羅 芳，陶金忠

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)系，銀川 750021)

受精后早期妊娠診斷是決定牛場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益高低的重要因素之一，人工授精后盡早識(shí)別未妊娠奶牛是減少因檢測(cè)發(fā)情效率低下而導(dǎo)致妊娠間隔延長(zhǎng)的最好方法。若不能盡早識(shí)別未妊娠奶牛，會(huì)導(dǎo)致下一次情期配種時(shí)間延長(zhǎng)，從而加大產(chǎn)犢間隔，引起牧場(chǎng)繁殖力低下和育種成本升高等一系列問(wèn)題[1]。早期妊娠診斷不僅影響牧場(chǎng)繁殖率，還會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)奶量降低，有研究報(bào)道，奶?？諔褧r(shí)間超過(guò)21 d(一個(gè)發(fā)情周期)，每頭奶牛的產(chǎn)奶量將會(huì)減少168～315 kg[2]。從授精當(dāng)天到第17天是精卵結(jié)合到妊娠識(shí)別的一個(gè)階段。奶牛妊娠建立是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，要經(jīng)歷排卵、受精、胚泡形成、孕體生長(zhǎng)、妊娠識(shí)別信號(hào)分泌以及胚胎和胎盤的發(fā)育等一系列復(fù)雜的反應(yīng)[3]。授精后15～17 d也被認(rèn)為是維持妊娠的關(guān)鍵時(shí)期，妊娠識(shí)別發(fā)生在配種后的15～17 d，而母體接納孕體的時(shí)間最晚不超過(guò)17 d[4]。在妊娠早期，孕體與母體之間建立密切聯(lián)系，孕體發(fā)育到囊胚期滋養(yǎng)外胚層開始分泌適當(dāng)?shù)目裹S體溶解信號(hào)(INF-τ)來(lái)阻斷子宮內(nèi)膜前列腺素(PGF2α)的產(chǎn)生，INF-τ會(huì)抑制黃體周期性溶解，保證孕酮正常分泌從而維持妊娠[5-6]。目前，生產(chǎn)上已經(jīng)通過(guò)經(jīng)直腸超聲檢測(cè)對(duì)奶牛進(jìn)行早期妊娠診斷，或者人工授精后35 d內(nèi)通過(guò)觸診子宮形態(tài)變化來(lái)判別妊娠狀態(tài)[7]。如果奶牛沒有妊娠且發(fā)情周期持續(xù)21 d，那么人工授精后的第27～29天相當(dāng)于發(fā)情周期的第6～8天。發(fā)情周期第6～8天時(shí)第一個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡達(dá)到其最大直徑[8]，如果在第6～8天給予PGF2α處理，母牛將于40～48 h 后開始發(fā)情[9]。未妊娠奶?？稍谌斯な诰蟮?7～29天使用PGF2a誘導(dǎo)黃體退化，并在檢測(cè)到發(fā)情后進(jìn)行重復(fù)的定時(shí)輸精或者再受精。因此，早期準(zhǔn)確的妊娠診斷可以減少奶牛空懷時(shí)間、縮短產(chǎn)犢間隔，進(jìn)一步提高牧場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益。

代謝組學(xué)是目前常用的系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)之一，主要研究機(jī)體受擾動(dòng)后相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000的內(nèi)源性小分子代謝物的動(dòng)態(tài)變化。近年來(lái)，代謝組學(xué)方法已被成功應(yīng)用于奶牛疾病診斷和生理機(jī)制以及包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在內(nèi)的疾病動(dòng)物模型的確證、藥物篩選、藥效及毒性評(píng)價(jià)、作用機(jī)制和臨床評(píng)價(jià)等方面[10]。超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UHPLC-QTOF/MS)具有UHPLC快速高效的色譜分離能力和QTOF的高分辨率、高靈敏度。目前，基于UHPLC-QTOF/MS的代謝組學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病標(biāo)志物的篩選及藥效毒性評(píng)價(jià)等多個(gè)領(lǐng)域。郭延生和陶金忠[11]應(yīng)用LC-Q/TOF-MS代謝組學(xué)方法對(duì)人工授精當(dāng)天和第17天的荷斯坦奶牛乳樣進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)牛奶中的L-酪氨酸、N-乙?；?L-酪氨酸、L-脯氨酸、四氫1-苯甲基-1, 2, 3, 4-四氫異喹啉、鳥苷和十七烷基肉堿有望成為妊娠識(shí)別期妊娠診斷標(biāo)識(shí)物，可為深入研究奶牛早期妊娠識(shí)別機(jī)理提供新視角。Yang等[12]基于UHPLC-QTOF/MS代謝組學(xué)技術(shù)研究高谷物飲食與肉牛生長(zhǎng)性能之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)飼喂高玉米日糧能夠增加瘤胃和血液中的脂多糖和有害代謝產(chǎn)物，這些差異代謝物及其相關(guān)代謝通路可能有助于探索飼喂高玉米日糧導(dǎo)致代謝性疾病的潛在生物標(biāo)志物。

本研究基于UHPLC-QTOF/MS的代謝組學(xué)方法對(duì)奶牛人工授精后第17天的血漿代謝輪廓及代謝物變化進(jìn)行研究，觀察胚胎發(fā)育過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)代謝物變化規(guī)律，尋找早期妊娠診斷的候選生物標(biāo)識(shí)物，為提高母畜受胎率奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Triple TOF 6600高分辨質(zhì)譜儀(AB SCIEX)，1290 UHPLC 超高壓液相色譜儀(Agilent)，Heraeus Fresco17低溫高速離心機(jī)(Thermo Fisher Sci-entific)，液相色譜柱(Waters ACQUITY UPLC BEH Amide，2.1*100 mm, 1.7 μm)，BSA124S-CW天平(Sartorius)，明澈 D24 UV純水儀(Merck Millipore)，YM-080S超聲儀(深圳市方奧微電子有限公司)，甲醇(CNW Technologies，67-56-1)，乙腈(CNW Technologies，75-05-8)，乙酸銨(CNW Technologies，631-61-8)，氨水(Ammonium hydroxide)，內(nèi)標(biāo)：L-2-氯苯丙氨酸(上海恒柏生物科技有限公司，103616-89-3)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與分組

以寧夏某奶牛場(chǎng)體重為(550±50)kg，體況評(píng)分相近的經(jīng)產(chǎn)(2～3胎次)健康荷斯坦奶牛為試驗(yàn)對(duì)象。同期發(fā)情后，在人工授精后第17天晨飼前對(duì)奶牛進(jìn)行尾靜脈采血，肝素抗凝后，3 000 r·min-1離心10 min，收集上層血漿，置于-80 ℃冰箱冷凍保存，以備后續(xù)分析。后期采用計(jì)步器對(duì)奶牛進(jìn)行發(fā)情鑒定，觀察記錄授精28 d前奶牛的返情情況，并且在授精第32天時(shí)采用B超儀進(jìn)一步進(jìn)行早期妊娠診斷，根據(jù)診斷結(jié)果將奶牛分為妊娠組(A組，n=12)和未妊娠返情組(B組，n=24)，將這兩組樣品進(jìn)行代謝組學(xué)分析。

1.3 樣本預(yù)處理

從-80 ℃冰箱中取出樣本，在 4 ℃環(huán)境下緩慢解凍后，分別移取100 μL 樣本至EP管中，加入400 μL 提取液(甲醇∶乙腈=1∶1(V/V)，含內(nèi)標(biāo)2 μg·mL-1)，渦旋混勻1 min；冰水浴超聲10 min；然后在-40 ℃條件下靜置60 min后在4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min；取上清425 μL于EP管中，真空干燥后加入100 μL 50%乙腈復(fù)溶，渦旋30 s，冰 水浴超聲10 min后在4 ℃，13 000 r·min-1條件下離心15 min；取70 μL上清液于進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測(cè)；同時(shí)，分別取所有樣品10 μL上清液混合成質(zhì)量控制(quality control, QC)樣品上機(jī)檢測(cè)。

1.4 樣本UHPLC-QTOF-MS分析

本研究整個(gè)分析過(guò)程樣品盤溫度始終為4 ℃，通過(guò)超高效液相色譜系統(tǒng)的液相色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離，分離結(jié)束后使用Thermo Q Exactive Orbitrap 質(zhì)譜儀進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。色譜分離時(shí)進(jìn)樣體積為2 μL，柱溫為25 ℃，流動(dòng)相流速為0.5 mL·min-1；液相色譜A相為水相，含25 mmol·L-1乙酸銨和25 mmol·L-1氨水；B相為乙腈，采用梯度洗脫。質(zhì)譜參數(shù)如下：氣體溫度為250 ℃；氣流為16 L·min-1；鞘氣溫度為350 ℃；鞘氣流量為12 L·min-1；霧化器為20 psi；碎裂機(jī)為175 V；毛細(xì)管電壓為3 000 V。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

使用ProteoWizard軟件將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)成mzXML格式，進(jìn)一步采用XCMS 程序進(jìn)行峰對(duì)齊、保留時(shí)間校正和峰面積提取。刪除組內(nèi)缺失值超過(guò)50%的離子峰面積數(shù)據(jù)，而缺失值未超過(guò)50%的離子峰面積數(shù)據(jù)按最小值的二分之一進(jìn)行填充。然后使用SIMCA-P14.1軟件對(duì)預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，主要包括無(wú)監(jiān)督的主成分分析(principal component analysis, PCA)和有監(jiān)督的正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)。PCA用于確定組內(nèi)聚集和組間分離趨勢(shì)，而OPLS-DA用于進(jìn)一步確定組間差異。使用PCA和OPLS-DA模型反映A、B兩組樣品代謝輪廓的變化，經(jīng)過(guò)7次循環(huán)交互驗(yàn)證得到模型解釋率(R2Y)和模型預(yù)測(cè)率(Q2)，當(dāng)R2Y和Q2大于0.4，Q2intercept<0時(shí)，認(rèn)為模型穩(wěn)定可靠。然后采用T檢驗(yàn)及差異倍數(shù)分析對(duì)VIP(variable importance in the projection)>1的代謝物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用P值表示，P<0.05說(shuō)明差異顯著。

1.6 差異代謝物的鑒定分析

差異代謝物的鑒定采用精確質(zhì)量數(shù)匹配(<25 ppm)與二級(jí)譜圖匹配相結(jié)合的方式，檢索對(duì)比在線HMDB(http://www.hmdb.ca)、KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)和 METLIN(http://metlin.scripps.edu/)數(shù)據(jù)庫(kù)；然后使用牛代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(DMDB, http://www.cowmetdb.ca/)進(jìn)行比對(duì)和校正。使用MetaboAnalyst 5.0(http://www.metaboanalyst.ca)和Origin8.0軟件中的ROC曲線對(duì)已經(jīng)鑒定的差異代謝物進(jìn)行聚類分析和分類識(shí)別。

2 結(jié) 果

2.1 血漿樣品代謝譜及數(shù)據(jù)分析

分別將QC樣本在正、負(fù)離子檢測(cè)模式下的總離子流圖(TIC)進(jìn)行譜圖疊加比較，結(jié)果顯示，在正、負(fù)離子模式下QC樣品TIC圖的保留時(shí)間和信號(hào)強(qiáng)度都基本重疊，說(shuō)明在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中儀器誤差帶來(lái)的變異很小，測(cè)得的數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。

由PCA得分圖(圖1)可知，A和B兩組樣品之間沒有呈明顯的分離趨勢(shì)，正負(fù)離子模式下AvsB組之間的模型解釋率(R2X)分別為0.433和0.518。進(jìn)一步使用有監(jiān)督正交偏最小二乘法來(lái)評(píng)估A、B兩組間的樣本差異，正負(fù)離子模式下AvsB 組OPLS-DA得分圖(圖2)的R2Y和Q2參數(shù)分別為0.941、-0.064和0.936、-0.268；AvsB 組Q2<0.4，說(shuō)明這兩組構(gòu)建的模型預(yù)測(cè)能力偏低，R2X和R2Y均>0.4，說(shuō)明從人工授精后奶牛血漿代謝物發(fā)生了改變。為驗(yàn)證OPLS-DA模型是否存在過(guò)擬合，采用200次排序檢驗(yàn)對(duì)OPLS-DA模型進(jìn)行驗(yàn)證，正負(fù)離子模式下的Q2intercept分別為-0.192和-0.260，Q2intercept均<0，說(shuō)明OPLS-DA 模型未過(guò)度擬合，OPLS-DA 模型可靠有效。

圖1 正(a)、負(fù)(b)離子模式下PCA-X得分圖

圖2 正(a)、負(fù)(b)離子模式下OPLS-DA得分圖

2.2 兩組樣品差異代謝物的篩選與鑒定結(jié)果

根據(jù)OPLS-DA模型得到的VIP值初步篩選出對(duì)兩組有分類識(shí)別能力的代謝物，然后對(duì)VIP>1的代謝物進(jìn)行單因素方差分析，再篩選出P<0.05、差異倍數(shù)(fold change, FC)>1.5或FC<0.67的差異代謝物，共篩選出18種滿足條件的差異代謝物，見表1。然后使用MetaboAnalyst 5.0(http://www.metaboanalyst.ca)對(duì)這18種候選代謝物進(jìn)行聚類分析，由圖3可知，除個(gè)別樣品外，A、B兩組樣品基本上呈分離趨勢(shì)。進(jìn)一步采用Origin8.0軟件中的ROC曲線篩選出8種AUC>0.8的代謝物，每種代謝物的AUC值見表1。

圖3 人工授精后第17天A、B兩組代謝物聚類分析熱圖

表1 已鑒定差異代謝物

3 討 論

有研究報(bào)道，妊娠母牛的胚胎植入前組織液中均發(fā)現(xiàn)甘氨酸濃度升高，并顯著高于其它氨基酸[13]。甘氨酸是妊娠期間DNA甲基化和蛋白質(zhì)合成所必需的一碳來(lái)源[14]。隨著妊娠時(shí)間增長(zhǎng)，甘氨酸由母體不斷向孕體供給，以滿足胚胎細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)發(fā)育的需求[15-16]。此外，甘氨酸還是天然的滲透壓調(diào)節(jié)劑，當(dāng)細(xì)胞被滲透壓脅迫時(shí)，甘氨酸能對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用。維持細(xì)胞形態(tài)和功能，減輕滲透壓的損傷，使細(xì)胞在不利的環(huán)境條件下仍然能夠正常生長(zhǎng)和增殖[17]。由于早期胚胎在輸卵管內(nèi)需要積累大量的甘氨酸來(lái)維持滲透壓，因此甘氨酸對(duì)維持早期胚胎滲透壓和胚胎體積正常有重要的調(diào)節(jié)作用，它能夠避免滲透壓變化導(dǎo)致的發(fā)育停滯現(xiàn)象，目前甘氨酸已是早期胚胎體外培養(yǎng)液中創(chuàng)造類似體內(nèi)輸卵管環(huán)境的重要成分之一[18-19]。因此，甘氨酸對(duì)早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要，隨著妊娠進(jìn)行，胚胎對(duì)甘氨酸的需求量不斷增加。本研究發(fā)現(xiàn)授精第17天血漿中妊娠組的甘氨酸含量顯著高于未妊娠返情組，這可能是由于母體妊娠需要大量的甘氨酸來(lái)滿足胚胎發(fā)育所致。

脯氨酸是合成蛋白質(zhì)、精氨酸和多胺(精胺、亞精胺和腐胺)的功能性氨基酸之一。通過(guò)激活mTOR信號(hào)通路促進(jìn)孕體蛋白質(zhì)合成和胚胎干細(xì)胞分化[20]。脯氨酸是DNA合成、細(xì)胞增殖和分化的關(guān)鍵調(diào)控因子，參與妊娠豬和綿羊的胎盤發(fā)育[21]。脯氨酸在鳥氨酸脫羧酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶和脯氨酸氧化酶的作用下合成多胺[22]，參與調(diào)節(jié)妊娠期間蛋白質(zhì)的合成以及多胺和一氧化氮的水平[23]。有研究表明，胎盤中的多胺和一氧化氮水平在妊娠初期達(dá)到最高[24]，而且胎盤發(fā)育與羊水中脯氨酸和多胺的濃度呈正相關(guān)，也就是說(shuō)，脯氨酸和多胺水平越高，越有利于胎盤發(fā)育[25]。說(shuō)明脯氨酸在胎盤生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用。本研究也得到一樣的結(jié)果，即第17天妊娠組脯氨酸的含量顯著高于未妊娠返情組，說(shuō)明妊娠早期需要大量的脯氨酸和多胺來(lái)促進(jìn)胎盤形成和發(fā)育。因此，妊娠期間補(bǔ)充脯氨酸可以改善多胺的合成，促進(jìn)胚胎發(fā)育和生長(zhǎng)。

肌氨酸是一種天然存在的氨基酸化合物，在骨骼肌、大腦和睪丸中均有存在。它主要參與機(jī)體能量代謝，并且還可以作為妊娠期間的能量緩沖劑，保護(hù)胚胎大腦免受缺氧缺血的傷害[26]。妊娠期間母體處于一種高強(qiáng)度的代謝狀態(tài)，母體需要充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣為胎盤發(fā)育提供良好的條件。肌氨酸通過(guò)肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)到組織中，并且大部分在細(xì)胞內(nèi)被磷酸化為磷酸肌酸，在能量需求高的組織中將二磷酸腺苷再生為三磷酸腺苷(ATP)，維持ATP的可用性[27-28]。子宮血流量減少導(dǎo)致胎盤供血不足會(huì)嚴(yán)重影響胎盤內(nèi)ATP的穩(wěn)態(tài)，會(huì)誘發(fā)胚胎生長(zhǎng)受限等一系列疾病[29]。肌氨酸和肌酸激酶之間的相互轉(zhuǎn)化是無(wú)氧條件下產(chǎn)生ATP的方法[30]。胎盤的肌氨酸需求一直依靠母體供給直到妊娠晚期[31]，妊娠后期給母體補(bǔ)充肌氨酸不但可以改善胚胎存活率，而且還能防止器官受損[32-33]。在妊娠期間外源性的補(bǔ)充肌氨酸能夠保護(hù)胎兒大腦免受因缺氧缺血、興奮性中毒或氧化應(yīng)激等相關(guān)傷害，并且不會(huì)對(duì)胚胎或母體造成傷害[34]。因此，妊娠期間補(bǔ)充肌氨酸更有利于胎盤保持代謝穩(wěn)態(tài)，確保胚胎健康發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，人工授精第17天的妊娠組肌氨酸含量顯著高于未妊娠返情組，這可能與早期胚胎發(fā)育密切相關(guān)。

纈氨酸是支鏈氨基酸中運(yùn)輸效率最高的一種機(jī)體必需氨基酸，它在調(diào)節(jié)蛋白合成、細(xì)胞增殖和信號(hào)通路激活等方面發(fā)揮重要作用[35]。有研究報(bào)道，母豬從妊娠到分娩，機(jī)體對(duì)乳腺蛋白的需求逐漸增加[36]。纈氨酸可以經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)氨基作用和氧化脫羧脫氫后進(jìn)入三羧酸循環(huán)提供能量，并為乳腺合成乳蛋白提供底物[37]。也可衍生成谷氨酸，被酰胺化或者轉(zhuǎn)胺化生成谷氨酰胺，合成丙氨酸、天門冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸和多胺[38]。而谷氨酰胺和多胺是胎盤生長(zhǎng)發(fā)育和血管形成的必需物質(zhì)，它們不但是組織蛋白的基本成分，而且還能刺激DNA的合成，促進(jìn)胎盤中的血管生長(zhǎng)，進(jìn)而改善胚胎存活與發(fā)育[39]。而本研究發(fā)現(xiàn)，授精后第17天妊娠組中纈氨酸-蛋氨酸的含量顯著高于未妊娠返情組，這可能與早期胎盤血管形成和生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)運(yùn)用UHPLC-QTOF-MS代謝組學(xué)方法對(duì)人工授精后第17天妊娠組和未妊娠返情組奶牛血漿代謝物及變化趨勢(shì)進(jìn)行研究。丙氨酸-亮氨酸、甘氨酸、脯氨酸、L-正亮氨酸、DL-苯丙氨酸、肌氨酸、吡咯-2-羧酸和纈氨酸-蛋氨酸8種代謝物有望成為妊娠早期識(shí)別奶牛妊娠狀態(tài)的候選生物標(biāo)志物。