段 彥，李順祥,2，黃 丹，周炎輝，楊富茗，周婷婷，王 智，李 娟,2

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410208；3.湖南奇異生物科技有限公司，湖南 長沙 410008）

油茶是山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）植物，廣泛種植于我國湖南、江西、廣西和海南等17個省區(qū)[1]，其種子可榨油（茶油）供食用。茶油為純天然的植物油脂，不含芥酸、膽固醇等對人體有害物質(zhì)，主含油酸、亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸及部分飽和脂肪酸等，且其組成比例與橄欖油相似，被譽為“東方橄欖油”[2]，還含有維生素E、角鯊烯、甾醇和酚酸等多種生物活性成分[3]，具有抗炎、抑菌、抗氧化、降血脂和促滲透等作用[4-7]。山茶屬油茶（Camellia oleifera Abel.）或小葉油茶（Camellia meiocarpa Hu ms.）成熟種子用壓榨法制得的脂肪油，現(xiàn)已收載于2020年版《中華人民共和國藥典》（一部），用于注射用茶油的原料及軟膏基質(zhì)[8]。茶油作為優(yōu)質(zhì)的植物油脂，綠色安全，營養(yǎng)成分豐富，在醫(yī)藥、保健食品和化妝品等領(lǐng)域有著廣闊的發(fā)展前景，具有極高的研究和應(yīng)用價值。目前，油茶是我國重要的木本油料作物，在國民健康和生產(chǎn)生活的地位中舉足輕重，黨中央、國務(wù)院高度重視，出臺了《全國油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2009—2020）》，2008—2020年間連續(xù)八次召開“全國油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)場會”，有力推動了油茶產(chǎn)業(yè)的跨越式發(fā)展，湖南省于2018年也明確提出了推動茶油品牌建設(shè)、打造油茶“千億產(chǎn)業(yè)”的發(fā)展目標。因此，開發(fā)高附加值油茶產(chǎn)品，對實現(xiàn)油茶“千億產(chǎn)業(yè)”的目標具有重要意義。

本研究對湖南省長沙市瀏陽湘純油茶種植基地進行了油茶種質(zhì)資源的調(diào)察，并采集10種油茶種質(zhì)資源的樣本，從油茶果葉性狀特征、茶油經(jīng)濟性狀、茶油理化常數(shù)和脂肪酸成分分析等方面考察油茶種質(zhì)資源，并對關(guān)鍵指標采用灰色關(guān)聯(lián)-TOPSIS法綜合評價不同油茶種質(zhì)資源，為優(yōu)選油茶品種，指導(dǎo)種植基地油茶的低產(chǎn)改造，進一步推動油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥物與試劑 油茶樣本：2019年10月24日采于長沙市瀏陽湘純油茶種植基地（113.5°E，28.3°N）。根據(jù)基地種植油茶植物的葉片和果實的形態(tài)特征，劃分為10種不同的油茶種質(zhì)資源，分別編號為YCZ-1、YCZ-2、YCZ-3、YCZ-4、YCZ-5、YCZ-6、YCZ-7、YCZ-8、YCZ-9和YCZ-10。（見圖1）

試劑：正己烷（國藥集團化學試劑有限公司，批號：T20111013）；乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20210514）；氫氧化鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20200826）；甲醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170421）；15%三氟化硼甲醇溶液（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20120129）；氯化鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20190826）和無水硫酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20160808）均為分析純；正庚烷（天津市化學試劑研究所，批號：20150712）為色譜純。

1.2 主要儀器 111-101-40型數(shù)顯游標卡尺（佛山市棱輝工量刃具有限公司）；BSA124S-CW型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；SB-5200DTD型超聲儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；AF-12A型打粉機（溫嶺市奧力中藥器械有限公司）；HH-600型水浴鍋（金壇市神科儀器廠）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；GC-MS-QP2010型氣質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津公司）；Aoc-20i自動進樣器；Edward E2M2.5真空泵；GC-MS solution工作站（日本島津公司）；標準譜庫為美國NIST質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫。

2 方 法

2.1 油茶外觀性狀的測定 每種油茶種質(zhì)資源隨機抽取3株采樣，采集全部果實和部分葉片，標記，編號。每種油茶樣本隨機選取12顆果實與12片葉子，用游標卡尺測量其果長、果直徑、葉長和葉寬，并計算其果形指數(shù)（果長/果直徑）和葉形指數(shù)（葉長/葉寬）。

2.2 油茶經(jīng)濟性狀的測定 用電子秤稱量每種油茶樣本所有果實總質(zhì)量，計算單株結(jié)實量；隨機抽取12顆果實，分別稱量果實和種子質(zhì)量，計算鮮果出籽率（種子鮮質(zhì)量/果實鮮質(zhì)量）；自然干燥后，稱量干燥后果實和種子質(zhì)量，計算干出籽率（種子干質(zhì)量/果實干質(zhì)量）；以正己烷為溶媒，回流提取每種油茶樣本茶籽仁粗粉，50 ℃減壓濃縮后得到茶油，稱重，計算出油率（茶油質(zhì)量/茶籽仁粗粉質(zhì)量）。

2.3 茶油理化常數(shù)的測定 參考2020年版《中華人民共和國藥典》（一部），測定茶油的酸值（通則0713）、皂化值（通則0713）和碘值（通則0713）等理化常數(shù)[8]。

2.4 茶油脂肪酸分析

2.4.1 樣品制備 取0.2 g茶油樣品，精密稱定，精密加入2%氫氧化鈉甲醇溶液8 mL，（80±1）℃水浴回流直至油滴消失。從回流冷凝器上端精密加入7 mL15%三氟化硼甲醇溶液，繼續(xù)回流2 min，用少量水沖洗回流冷凝器，迅速冷卻至室溫，精密加入30 mL正庚烷，振搖2 min，再加入飽和氯化鈉水溶液，靜置分層，移取上層正庚烷液5 mL，至25 mL試管中，加入3.5 g無水硫酸鈉，振搖1 min，靜置5 min，吸取上層液至進樣瓶中待測定[9]。

2.4.2 色譜質(zhì)譜條件[10]色譜條件：色譜柱為DB-5石英毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度為240 ℃；載氣為氦氣（100 kPa）；分流比為10∶1；升溫程序：初始100 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至250 ℃，保持20 min。質(zhì)譜條件：離子源為EI；電離電壓：70 eV；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：250 ℃；質(zhì)譜范圍：35-650 Amu；掃描周期：0.5 s。

研究中發(fā)現(xiàn)，單一層面切片的HE染色，前哨淋巴結(jié)發(fā)現(xiàn)45枚(8例)(17.7%)、非前哨淋巴結(jié)41枚(14例)(34.1%)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。對365枚前哨淋巴結(jié)行多層切片HE染色及免疫組化染色檢測，發(fā)現(xiàn)單層切片常規(guī)HE染色前哨淋巴結(jié)均有微小轉(zhuǎn)移，余下HE染色陰性的前哨淋巴結(jié)有微小轉(zhuǎn)移灶，直徑均小于2 mm，累計有96枚前哨淋巴結(jié)內(nèi)有轉(zhuǎn)移灶。

2.5 灰色關(guān)聯(lián)-TOPSIS法綜合評價油茶種質(zhì)資源 選取能反映茶油產(chǎn)量的經(jīng)濟性狀（單株結(jié)實量、鮮果出籽率、干出籽率和出油率）及反映茶油品質(zhì)差異的質(zhì)量指標（酸值、皂化值、碘值、油酸、棕櫚酸和硬脂酸）為綜合評價指標，構(gòu)建灰色關(guān)聯(lián)-TOPSIS綜合評價模型，對10種油茶種質(zhì)資源進行綜合品質(zhì)評價。

2.5.1 最優(yōu)及最差指標的確定 設(shè)有m個樣品，每個樣品有n項評價指標，由此組成評價單元序列{Xij}（i=1，2，3，……，m；j=1，2，3，…，n；本研究中m=10，n=10）。評價指標統(tǒng)一后，設(shè)其中最優(yōu)參考序列記為{Xsj}，最差參考序列記為{Xtj}。其中最優(yōu)參考序列的各項指標是m個樣品對應(yīng)指標的最大值，最差參考序列的各項指標是m個樣品對應(yīng)指標的最小值。

2.5.2 原始數(shù)據(jù)標準化處理 按公式Y(jié)ij=Xij/Xj對原始數(shù)據(jù)進行規(guī)格化處理，其中Yij為規(guī)格化處理后的數(shù)據(jù)，Xij為原始數(shù)據(jù)，Xj為第n個樣品第j個指標的均值。

2.5.3 熵權(quán)法客觀賦權(quán)[11]根據(jù)信息熵的計算公式，計算各個指標的信息熵（E），分別為E1、E2、E3、…、Ej，通過信息熵計算各指標的權(quán)重Wj。計算公式如下：

2.5.4 灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)的計算[12]計算相對于最優(yōu)參考序列和最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)，公式如下：

本實驗ρ取值為熵權(quán)法計算所得各指標權(quán)重Wj。

2.5.5 相對接近程度的計算[13]根據(jù)灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)矩陣ξ，確立最優(yōu)值向量（ξ+）和最劣值向量（ξ-），其中ξ+對應(yīng)矩陣ξ每一列的最大值，ξ-對應(yīng)矩陣ξ每一列的最小值；計算各評價對象各指標與最優(yōu)值、最劣值的歐氏距離D+i和D-i。計算公式如下：

根據(jù)歐氏距離D+i和D-i計算各評價對象指標值與最優(yōu)值的相對接近程度，以Ci的大小衡量各評價對象的優(yōu)劣，Ci越大，表示越接近最優(yōu)水平。計算公式如下：

3 結(jié)果

表1 不同種質(zhì)油茶的果實和葉片特征

表2 不同種質(zhì)油茶的果實和葉片測定數(shù)據(jù)（，n=12）

表2 不同種質(zhì)油茶的果實和葉片測定數(shù)據(jù)（，n=12）

圖1 不同種質(zhì)油茶果實和葉片圖

3.2 油茶經(jīng)濟性狀的測定 單株結(jié)實量是油茶籽產(chǎn)量的重要指標，10種油茶種質(zhì)資源的單株結(jié)實量差異較大，最大的是YCZ-10，為（1 911±102）g，最小的是YCZ-9，為（368±97）g，相差接近5倍；出籽率和出油率則能直觀反映茶油的產(chǎn)量，出籽率分為鮮果出籽率和干出籽率，在10種油茶種質(zhì)資源中，YCZ-3鮮果出籽率和干出籽率最大，分別為（68.77±2.42）%和（71.13±2.51）%，YCZ-7鮮果出籽率最小，為（28.64±2.50）%，YCZ-10干出籽率最小，為（38.48±3.05）%，10種油茶種質(zhì)資源中出油率最高的是YCZ-4，為（46.67±0.79）%，最低的是YCZ-10，為（31.23±0.38）%，各經(jīng)濟性狀測定數(shù)據(jù)見表3。單株結(jié)實量、出籽率和出油率等經(jīng)濟性狀能從各方面反映油茶種質(zhì)的優(yōu)劣，10種油茶種質(zhì)資源的經(jīng)濟性狀均有一定的差異，但單獨考察各項指標不能合理有效評價油茶品種質(zhì)量，故需綜合各指標對油茶進行質(zhì)量評估，才更具科學性。

表3 不同種質(zhì)油茶的經(jīng)濟性狀（，n=3）

表3 不同種質(zhì)油茶的經(jīng)濟性狀（，n=3）

3.3 茶油理化常數(shù)的測定 茶油的理化性質(zhì)能反映其品質(zhì)，酸值是衡量茶油中游離脂肪酸含量的指標，可以反映茶油的新鮮度和酸敗變質(zhì)情況。皂化值可反映茶油的平均分子量大小。碘值可以說明茶油組成中不飽和脂肪酸的多少和不飽和程度的大小。茶油品質(zhì)的優(yōu)劣可以根據(jù)這些指標來評價。10種茶油中YCZ-1酸值最高，為（2.85±0.21）mg/g，YCZ-8酸值最低，僅為（2.02±0.23）mg/g；其皂化值差異較大，在（173.54±4.09）～（199.13±3.54）mg/g之間；YCZ-3的碘值最高，為（87.87±3.08）g/100 g，YCZ-5碘值最低，為（80.62±2.34）g/100 g。（見表4）

表4 不同種質(zhì)茶油理化常數(shù)測定結(jié)果（n=3）

3.4 茶油GC-MS分析結(jié)果 采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對茶油中脂肪酸組成進行檢測，總離子流圖見圖2，主要成分及其相對百分含量見表5。10種茶油中共檢測到9個成分，均含有的成分是油酸、棕櫚酸、硬脂酸、肉豆蔻酸和十七烷，部分茶油中未檢測到二十烷、棕櫚油酸、順式-10-十七碳烯酸和順式-11-二十碳烯酸等4個成分。

圖2 茶油GC-MS 總離子流色譜圖

表5 不同種質(zhì)茶油脂肪酸組成分析

茶油中的不飽和脂肪酸主要是油酸，10種茶油中油酸相對含量差異不大，最高的是YCZ-5，為90.16%，最低的是YCZ-1，為86.09%，飽和脂肪酸主要是棕櫚酸和硬脂酸。YCZ-1棕櫚酸含量最高，為10.38%，YCZ-2含量最低，為6.76%，硬脂酸含量在1.26%～3.53%。其他成分如肉豆蔻酸、棕櫚油酸等則相對含量較少，均低于1%。

3.5 灰色關(guān)聯(lián)-TOPSIS法綜合評價油茶種源

3.5.1 熵權(quán)法客觀賦權(quán) 采用熵權(quán)法對10個評價指標進行客觀賦權(quán)，各評價指標的信息熵和權(quán)重系數(shù)見表6。各指標信息熵的大小排序為：棕櫚酸＞皂化值＞硬脂酸＞油酸＞碘值＞酸值＞干出籽率＞出油率＞單株結(jié)實量＞鮮果出籽率，權(quán)重系數(shù)正好相反，說明對油茶種質(zhì)資源影響最大的是鮮果出籽率，其次是單株結(jié)實量、出油率和干出籽率，其他指標影響較小。此外，各評價指標權(quán)重系數(shù)均不相同，說明不同指標對油茶質(zhì)量的貢獻程度也不一樣。

表6 熵權(quán)法計算所得信息熵及權(quán)重

3.5.2 10種油茶種質(zhì)資源的相對接近程度及排序 按照TOPSIS分析法的步驟對不同種質(zhì)的油茶進行灰色關(guān)聯(lián)-TOPSIS評價，并排序，其結(jié)果見表7。相對接近度Ci的值越大表明該評價對象越接近最優(yōu)水平，Ci的值越小表示該評價對象越接近最差水平。評價結(jié)果顯示，YCZ-3相對接近度最大，為0.599，其次是YCZ-2（0.594），兩種油茶的相對接近程度相近，表明這兩種油茶種質(zhì)資源品質(zhì)基本一致，另外8種油茶種質(zhì)資源相對接近度與這YCZ-3和YCZ-2相差較大，說明這兩種油茶種質(zhì)資源質(zhì)量明顯優(yōu)于其他8種，相對于其具有更大的優(yōu)勢，是品種優(yōu)良的油茶資源。

表7 不同種質(zhì)油茶灰色關(guān)聯(lián)-TOPSIS 評價及排序

4 討論

本研究測定了油茶籽的經(jīng)濟性狀和茶油的理化指數(shù)，并運用GC-MS技術(shù)對茶油脂肪酸組成進行了分析，選取單株結(jié)實量、鮮果出籽率、干出籽率、出油率、酸值、皂化值、碘值、油酸、棕櫚酸和硬脂酸為綜合評價指標，以熵權(quán)法計算各指標的權(quán)重，結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)法和TOPSIS法構(gòu)建綜合評判模型，以相對接近度為測度來綜合評價湖南產(chǎn)不同油茶種質(zhì)資源的品質(zhì)。

灰色系統(tǒng)能利用己知信息通過關(guān)聯(lián)度去揭示未知信息，對數(shù)據(jù)容量和概率分布沒有嚴格要求，只需較少的原始數(shù)據(jù)，便可尋找體系中的規(guī)律性，被廣泛運用于多指標中藥材質(zhì)量的綜合評價[14-17]。本研究采用灰色關(guān)聯(lián)-TOPSIS綜合評判模型[18]，該模型在傳統(tǒng)TOPSIS法的基礎(chǔ)上引入灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)。TOPSIS法通過計算相對距離來反映序列間線性變化關(guān)系，也體現(xiàn)了曲線趨勢，同時以熵權(quán)法對各評價指標賦權(quán)，避免了主觀賦權(quán)法的主觀性和不確定性，使評價結(jié)果更加科學準確、客觀、合理。

研究結(jié)果顯示，YCZ-3是綜合評價排序最高的油茶種質(zhì)資源，其次是YCZ-2，但兩種油茶種質(zhì)資源的相對接近程度相近，即兩種油茶的品種質(zhì)量基本一致，故油茶種植基地在選取優(yōu)質(zhì)種源時應(yīng)主要考慮這兩種油茶。此外，研究發(fā)現(xiàn)，對油茶品種質(zhì)量貢獻較大的多為油茶的經(jīng)濟性狀，而茶油的理化常數(shù)和脂肪酸組成對油茶品種質(zhì)量的影響較小，說明種植基地的10種油茶所產(chǎn)出的茶油在質(zhì)量上區(qū)別不大，主要影響因素是油茶籽和茶油的產(chǎn)量，故在后續(xù)的種植和生產(chǎn)過程中應(yīng)注重產(chǎn)量方面的問題，如：施加合適的肥料，調(diào)節(jié)種植密度，來提高油茶籽的產(chǎn)量，優(yōu)化制油工藝，提高出油率等。

油茶種植基地現(xiàn)存10種不同的油茶種質(zhì)資源，其中部分油茶因種源限制，相對于優(yōu)良品種，產(chǎn)生的經(jīng)濟效益較低，但同樣會占用土地、水利等資源，故應(yīng)對10種油茶種質(zhì)資源進行綜合評價，篩選優(yōu)良的油茶品種，為后期的良種繁育、油茶林的低產(chǎn)改造提供科學依據(jù)。