聶廣辰，薛 巖,郝旭光，劉 麗，石 健，房玉利，劉 勇

哈爾濱市五院骨外科，哈爾濱 150088

周圍神經(jīng)損傷臨床發(fā)病率極高，中國每年新增周圍神經(jīng)損傷患者60萬～90萬例，且大部分患者需要神經(jīng)移植進行修復[1-2]。在周圍神經(jīng)損傷的患者中只有不到一半恢復良好的感覺和運動功能[3]。周圍神經(jīng)損傷現(xiàn)階段恢復連續(xù)性的方法為外膜縫合、束膜縫合、外膜聯(lián)合束膜縫合，這些方法在不能明確鑒別神經(jīng)的運動、感覺束的情況下，均難以避免神經(jīng)功能束的錯誤匹對，且斷端神經(jīng)因為延遲修復導致連續(xù)性恢復的過程受阻，錯過了修復時機，導致神經(jīng)纖維瘤的形成[4]。近年來對周圍神經(jīng)損傷修復的研究中，動脈套管及聚乙二醇(PEG)表現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢，其中動脈套管的作用機制在于周圍神經(jīng)損傷后，神經(jīng)近端的再生過程表現(xiàn)出趨化性，如果有一定空間的間隙，新生的運動、感覺神經(jīng)纖維可以經(jīng)它自動長入遠端相應的功能束中，最后到達靶器官[5-7]。PEG作為一種非離子化親水性聚合物，在生物化學和藥物學上應用廣泛，常用作細胞融合相關(guān)領(lǐng)域所需的乳化劑以及均質(zhì)物質(zhì)[8]。PEG 能夠在生物體內(nèi)環(huán)境形成對周圍水分結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)化作用[9]，形成相對的疏水結(jié)構(gòu)域，這種特殊的結(jié)構(gòu)域能減少細胞膜產(chǎn)生的線性彈性，促使破裂細胞膜發(fā)生融合，同時促進鄰近磷脂層的再塑，為細胞結(jié)構(gòu)和功能的再塑提供良好條件。在哺乳動物中軸突的離斷常導致不可逆性的遠端軸突的華勒變性，但近端節(jié)段功能尚保存，PEG可通過軸突融合在細胞水平連接損傷神經(jīng)的遠端和近端，避免損傷遠端神經(jīng)的華勒變性，促進周圍神經(jīng)再生[10]。動脈套管及PEG在周圍神經(jīng)損傷的修復中，單獨的報道很多，但兩者聯(lián)合應用的文獻鮮有報道。本研究通過構(gòu)建大鼠坐骨神經(jīng)損傷動物模型，聯(lián)合兩種方法進行修復，旨在為臨床上周圍神經(jīng)損傷患者提供一種新的治療思路。

材料與方法

1 實驗分組及動物模型的制備

本研究實驗動物購自哈爾濱醫(yī)科大學附屬二院動物實驗中心，雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠體重(200～250g)。本研究動物實驗操作均嚴格按照哈爾濱醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會制訂的《哈爾濱醫(yī)科大學動物實驗操作規(guī)范》執(zhí)行。

實驗分組，共144只大鼠，平均分為4組，每組36只。A組：小間隙縫合生理鹽水沖洗；B組：小間隙縫合PEG沖洗；C組：動脈套管(同種異體血管)聯(lián)合小間隙縫合生理鹽水沖洗；D組：動脈套管聯(lián)合小間隙縫合PEG沖洗。對實驗大鼠腹腔內(nèi)注射麻醉藥戊巴比妥鈉(60mg/kg)，備皮后對右后肢進行手術(shù)。將大鼠翻至俯臥位并固定四肢，找到大鼠右側(cè)大腿股骨位置，以此為骨性標志在股骨下 0.5cm 處淺層剪開皮膚，作一1～2cm切口，切口位置為股骨在體表的投影位置。打開皮膚后可見一條明顯的白線，為肌肉間的筋膜，在顯微鏡下，沿此白線將其剪開一個小口，深入血管鉗沿白線方向鈍性分離，用顯微剪刀銳性分離坐骨神經(jīng)周圍的結(jié)締組織，暴露坐骨神經(jīng)干。將A組和B組大鼠坐骨神經(jīng)游離暴露1cm左右，并在手術(shù)顯微鏡下于中間切斷并立即小間隙縫合(1mm)，將生理鹽水(0.5mL，A組)或 PEG-600(西安晉湘藥用輔料有限公司，0.5mL，B組)注入縫合界面。將C組和D組大鼠暴露1cm的坐骨神經(jīng)然后于中間切斷。將近端和遠端殘端插入主動脈套管的兩端，然后將套管的兩個末端固定到神經(jīng)外膜上，最后將鹽水(0.5mL，C組)或PEG-600(0.5mL，D組)注入動脈導管(圖1)。所有組進行止血并以標準方式閉合傷口。

圖1 小間隙縫合及動脈套管使用示意圖

將所有大鼠放置在舒適的環(huán)境中，12h/12h交替光暗循環(huán)并自由喂食。

本研究設計涉及4組SD大鼠(n=144)，每組在1、4周和8周各評估12只大鼠(n=36)。1周，每組9只大鼠進行行為學評估及電生理檢測，3只取材坐骨神經(jīng)組織，進行組織學評估以及電鏡觀察。

2 行為學坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)檢測

該項評估在自制坐骨神經(jīng)指數(shù)盒內(nèi)進行，制作一高10cm、長60cm、寬10cm、兩端開口的木質(zhì)通道，將白紙裁成與木質(zhì)通道等長等寬鋪至木板表面。訓練大鼠自行通過木板行走。用染料使大鼠雙下肢染色，大鼠置于通道的一開口端，任其行走至另一開口端，雙下肢在白紙上可留下5～6個腳印。評估利用了包括感覺反饋和運動控制在內(nèi)的SFI。選擇印跡清晰的足印分別測量正常足(N)和傷側(cè)足(E)的3個指標：PL(腳印長度)、TS(趾寬度)、IT(中間趾寬度)。把獲得的指標代入Bain[9-10]公式，最后獲得SFI。從第3周開始，SFI值有較強指導意義[11]。SFI的評價標準為：SFI=0為運動感覺功能正常，SFI=100為神經(jīng)完全損傷。

3 電生理學檢測

復合肌肉動作電位(CMAP)是指電刺激坐骨神經(jīng)，記錄遠端坐骨神經(jīng)所支配的腓腸肌同步放電的電生理信號，評估受損的坐骨神經(jīng)恢復情況。受檢大鼠腹腔注射麻醉后，暴露并游離包括動脈套管在內(nèi)的約2cm坐骨神經(jīng)，將鉤形刺激電極放置在離近端神經(jīng)約1cm處。將針記錄電極放置在相應的目標腓腸肌上測量CAMP并觀察記錄其振幅。

4 組織病理學檢測

取縫合部位的神經(jīng)節(jié)段和目標腓腸肌，并對其進行處理，以對治療后的神經(jīng)進行組織學分析。HE染色觀察各組腓腸肌萎縮情況及神經(jīng)再生排序情況。透射電子顯微鏡觀察再生神經(jīng)纖維數(shù)量、軸突及髓鞘外觀。

5 統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

1 實驗動物情況

在本實驗中A組及C組大鼠各有1只因麻醉意外死亡，其余大鼠在飼養(yǎng)過程中無意外死亡發(fā)生。

2 行為學結(jié)果

結(jié)果顯示D組在任何時間節(jié)點數(shù)據(jù)明顯優(yōu)與其他三組，且差異有統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 坐骨神經(jīng)指數(shù)計算數(shù)值分)

3 電生理學結(jié)果

術(shù)后1、4、8周行混合肌肉運動電位CMAP檢查。術(shù)后第1周D組動作電位峰值顯著高于其余三組，術(shù)后4周及8周，B組動作電位峰值有所提高，但顯著低于D組，A組及C組動作電位恢復不良。結(jié)果提示接受PEG的沖洗對周圍神經(jīng)正常的生物電傳導功能恢復有幫助。見圖2。

圖2 各組腓腸肌的體內(nèi)復合肌肉動作電位(CMAP)

4 HE染色

通過GraphPad Prism 6 圖像軟件分析，觀察肌肉纖維化程度、肌肉纖維排列的順序和形態(tài)。術(shù)后1周各組可觀察到肌肉萎縮，各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。A組和C組在4周時萎縮顯著，而B組及D組則萎縮較少。在8周時，A組和C組的肌肉萎縮情況進一步加重，而B組及D組無論是在肌肉纖維化程度、排列的順序及形態(tài)上較4周時無明顯變化。在4周和8周對坐骨神經(jīng)斷端進行HE染色時，目視檢查 B組及D組中再生纖維有序排列，具有正常直徑和施萬細胞數(shù)；成纖維細胞增生很少。A組呈現(xiàn)無序排列，少量再生纖維和稀疏的施萬細胞，C組情況略好于A組。見圖3。

圖3 HE 肌肉(左)和神經(jīng)(右)染色

5 透射電子顯微鏡

術(shù)后4周，尤其是術(shù)后8周，D組再生神經(jīng)纖維數(shù)最多，軸突最厚，髓鞘外觀正常。在B組中，軸突是圓形的，偶有扭曲。再生神經(jīng)纖維的數(shù)量不高，但軸突顯示有序排列，有較規(guī)則的髓鞘層狀分層。而A組及C組中，再生軸突呈不規(guī)則樣，纖維數(shù)較少，髓鞘變形且薄、不規(guī)則。 見圖4。

圖4 透射電子顯微鏡顯示術(shù)后4周和8周軸突形態(tài)的變化

討 論

周圍神經(jīng)重建的效果一直不理想，高質(zhì)量顯微設備和顯微器械的出現(xiàn)，伴隨的顯微鏡下操作能力的提升使得顯微修復技術(shù)和顯微外科得到了迅速的發(fā)展[12-14]。近年來，PEG及動脈套管在治療周圍神經(jīng)損傷上取得了較大的進展，但將兩者聯(lián)合應用于周圍神經(jīng)損傷報道較少。

PEG治療周圍神經(jīng)損傷的主要機制是PEG作為一種膜融合劑，能夠在周圍神經(jīng)損傷早期促進軸索細胞膜融合、線粒體膜通透性降低、細胞色素C釋放、Ca2+濃度調(diào)控，進而延緩華勒變性[15]。然而，僅用PEG進行軸突融合并不能完全避免華勒變性，因為細胞骨架并未完全修復，細胞骨架的迅速重建對于恢復軸突轉(zhuǎn)運至關(guān)重要，重建神經(jīng)連續(xù)性和良好的生物力學環(huán)境也不可或缺。

動脈套管聯(lián)合小間隙縫合很好解決了神經(jīng)連續(xù)性恢復的問題，動脈套管聯(lián)合小間隙縫合的應用已有近20年歷史，近似封閉的動脈套管環(huán)境為近端與遠端神經(jīng)提供了營養(yǎng)支持，形成了一個有利于神經(jīng)修復的微環(huán)境[16]。將離斷神經(jīng)近端和遠端分別插入套管內(nèi)中間保留間隙，近端神經(jīng)高度選擇性地長入到遠端相應位置，避免了標準神經(jīng)修復模式下近遠端匹配錯位的問題。本研究應用大鼠自體動脈作為套管橋接神經(jīng)斷端，但在臨床工作中選用自體血管作為動脈套管增加患者副損傷同時也受到大小等方面的限制[17-18]。目前臨床上可應用的套管分為自體動脈套管和可降解生物型套管。可降解生物型套管材質(zhì)多樣，但作用機理及效果大致相同。

本研究創(chuàng)新性地應用了PEG沖洗動脈套管聯(lián)合小間隙縫合法縫合的神經(jīng)斷端，包括電生理學、行為學、組織學在內(nèi)的結(jié)果共同顯示，1mm小間隙動脈套管聯(lián)合PEG沖洗可使周圍神經(jīng)離斷損傷后形態(tài)甚至肢體功能恢復接近正常，效果明顯優(yōu)于單獨應用PEG及單獨應用動脈套管。

本研究未能在更多的時間點取材并進行所述檢測，也未能完成遠期大鼠下肢功能恢復情況的觀察，未能驗證PEG應用的長期效果。并且PEG對于周圍神經(jīng)功能的影響，包括運動和電生理學上的影響作用具體到何種程度，其具體作用機制尚未完全明了；實驗組采用PEG600斷端沖洗，不同分子量及PEG的應用方式也未進行對比，有待進一步研究。本實驗采用動脈套管為5mm，神經(jīng)斷端保留小間隙1mm，不同的套管長度及小間隙長度對神經(jīng)重建的影響也有待進一步驗證。動脈套管聯(lián)合小間隙縫合PEG沖洗在體內(nèi)對周圍神經(jīng)損傷修復的具體作用以及分子機制也還需要進一步探究。但從現(xiàn)有的數(shù)據(jù)來看，PEG聯(lián)合動脈套管在治療大鼠周圍神經(jīng)損傷上效果明顯優(yōu)于兩者單獨應用，可為臨床治療周圍神經(jīng)損傷提供一種新的思路。