劉娜

（河北省饒陽(yáng)縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心河北衡水 053900）

動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)是一種主動(dòng)、系統(tǒng)深入的資料記錄形式，是指對(duì)某種或某些疫?。ò▊魅静『头莻魅静。╅L(zhǎng)期、完整、連續(xù)定期的觀察，收集，核對(duì)，分析疫病動(dòng)態(tài)分布和影響因素資料，跟蹤疫病的發(fā)生、分布和變化趨勢(shì)，并將信息及時(shí)上報(bào)和反饋，以便進(jìn)一步開展調(diào)查研究，對(duì)疫病進(jìn)行預(yù)警預(yù)報(bào)，提出有效的防控對(duì)策和措施，從而達(dá)到防控疫病的目的。

疫情監(jiān)測(cè)方案具體到日常上級(jí)下達(dá)的監(jiān)測(cè)任務(wù)和跨省調(diào)運(yùn)需要監(jiān)測(cè)的臨時(shí)監(jiān)測(cè)，及每年春秋季防疫后的集中監(jiān)測(cè)。動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)一直以來是動(dòng)物疫病預(yù)防控制的主要內(nèi)容之一，有效的動(dòng)物防疫以及動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)，能夠保證相關(guān)養(yǎng)殖人員及時(shí)地掌握動(dòng)物生長(zhǎng)實(shí)際，并及時(shí)掌握疫病和疫情的實(shí)際狀況，結(jié)合實(shí)際和現(xiàn)有的防疫手段、監(jiān)測(cè)手段等，去進(jìn)行免疫工作，可依據(jù)檢測(cè)記錄去及時(shí)調(diào)整防疫措施、控制疫情?，F(xiàn)就今年春季奶牛口蹄疫集中免疫抗體監(jiān)測(cè)為例闡述如下。

1 采集樣品具體信息

某翔和某凱兩家奶牛養(yǎng)殖企業(yè)，采樣奶牛日齡均為成年泌乳牛，采樣數(shù)量均為60 份。某凱奶牛場(chǎng)免疫的是中農(nóng)威特的口蹄疫疫苗，免疫時(shí)間為2021 年4 月15 日。某翔奶牛場(chǎng)免疫的是天康生物股份有限公司的口蹄疫疫苗，免疫時(shí)間為2021 年3 月1 日。臨床表現(xiàn)均為采食正常，健康牛。試劑盒采用的是青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心生產(chǎn)的口蹄疫病毒O 型競(jìng)爭(zhēng)ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒和蘭州獸研生物科技有限公司生產(chǎn)的改進(jìn)型口蹄疫病毒O 型液相阻斷ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒。

2 試驗(yàn)準(zhǔn)備

試劑盒、樣品放置室溫25℃平衡30min 以上；恒溫箱調(diào)至37℃；洗滌液按說明書倍數(shù)稀釋；酶標(biāo)儀調(diào)至450nm 狀態(tài)；實(shí)驗(yàn)操作在血清學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全柜進(jìn)行；移液器按所需量程準(zhǔn)備；嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.1 口蹄疫病毒O 型競(jìng)爭(zhēng)ELISA 抗體檢測(cè)

酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)陰性血清對(duì)照值為2.494 和2.509，陽(yáng)性血清對(duì)照值為0.095 和0.086，陰性血清的平均OD 值為2.5015，大于0.5，且陽(yáng)性血清抑制率為96.3%，大于50%，試驗(yàn)結(jié)果有效，試驗(yàn)成立。讀取數(shù)值結(jié)果，某凱奶牛場(chǎng)的樣品數(shù)值在0.052～0.203 之間，經(jīng)判定全部樣品為陽(yáng)性。某翔奶牛場(chǎng)的樣品數(shù)值在0.605～0.819 之間，經(jīng)判定樣品全部為陽(yáng)性。

2.2 改進(jìn)型口蹄疫病毒O 型液相阻斷ELISA 抗體檢測(cè)

采取的20 份樣品的布局，加入病毒抗原后樣品血清的稀釋度第一孔為1：16，然后倍比向下稀釋至1：128。陽(yáng)性對(duì)照的稀釋度為1：32，然后倍比向下稀釋至1：4096。陰性對(duì)照血清設(shè)兩個(gè)孔稀釋度分別為1：4 和1：8。酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)陰性血清對(duì)照值為1.818 和1.879，病毒抗原對(duì)照值為2.101、2.078、2.117、2.085，陽(yáng)性血清對(duì)照一列數(shù)值依次為0.102、0.136、0.235、0.495、0.925、1.434、1.702、1.974。依據(jù)試驗(yàn)成立條件：病毒抗原對(duì)照D450nm 值在1.0以上。陽(yáng)性對(duì)照抗體效價(jià)在1：1024± 1 滴度以內(nèi)。陰性對(duì)照血清抗體效價(jià)＜1：8，試驗(yàn)結(jié)果有效，試驗(yàn)成立。讀取數(shù)值結(jié)果，某翔奶牛場(chǎng)的樣品第一排稀釋度1：16 數(shù)值在0.081～0.269 之間，第四排稀釋度1：128 數(shù)值在0.104～0.301 之間。經(jīng)判定全部樣品為陽(yáng)性。?？贵w效價(jià)均≥1：128，99%以上保護(hù)。某凱奶牛場(chǎng)的的樣品第一排稀釋度1：16 數(shù)值在0.077～0.131 之間，第四排稀釋度1：128數(shù)值在0.167～0.360 之間，經(jīng)判定樣品全部為陽(yáng)性。牛抗體效價(jià)均≥1：128，99%以上保護(hù)。

2.3 兩種試劑盒的比較

口蹄疫病毒O 型競(jìng)爭(zhēng)ELISA 抗體檢測(cè)是定性檢測(cè)，只能判斷免疫的奶牛血清中抗體是否產(chǎn)生，不能判斷免疫的奶?？贵w的保護(hù)率。操作快捷，用時(shí)較短，樣品布板份數(shù)多。改進(jìn)型口蹄疫病毒O型液相阻斷ELISA 抗體檢測(cè)是定量檢測(cè)，能精準(zhǔn)到保護(hù)率高低多少。但同時(shí)操作的份數(shù)較少，相對(duì)用時(shí)就會(huì)長(zhǎng)些。

3 注意事項(xiàng)

1）血清的采集。采集過程中防止溶血，溶血會(huì)導(dǎo)致吸光度升高，影響檢測(cè)結(jié)果。血液應(yīng)在室溫中凝固20～30min，然后2,000～3,000r/min 離心，取上清部分，血清量應(yīng)足夠檢測(cè)所需。

2）移液器。使用的移液器要定期校準(zhǔn)，確保試劑用量精準(zhǔn)，檢測(cè)數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)。

3）吸頭：配合移液器量程使用。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品不能重復(fù)使用同一個(gè)吸頭加樣。加入不同樣品和不同試劑成分時(shí)，應(yīng)該更換移液器吸頭，以避免出現(xiàn)交叉污染。

4）洗滌液、稀釋液配置以及盛放洗滌液的容器應(yīng)保持清潔，以防止微生物污染導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。按照說明書的比例配制洗滌液。如20 倍稀釋，即1mL 濃縮洗滌液加入19mL 蒸餾水。稀釋后的洗液可在室溫下保存24h。如果出現(xiàn)結(jié)晶物，可放置于37℃恒溫箱內(nèi)5～10min。濃縮洗滌液出現(xiàn)渾濁或絮狀物請(qǐng)勿使用。

5）加樣：調(diào)整移液器刻度，設(shè)定容量值。移液器移取液體試劑和樣品血清。吸取液體時(shí)，移液器保持豎直狀態(tài)，將吸頭插入液面下2～3mm，用大拇指將移液器頂部按鈕按至第一停點(diǎn)，然后慢慢松開按鈕回原點(diǎn)，接著將按鈕按至第一停點(diǎn)排出液體稍停片刻繼續(xù)按按鈕至第二停點(diǎn)吹出殘余的液體后松開按鈕。使用多道（如8道或12 道）移液器，則可以將移液器的第一道對(duì)準(zhǔn)第一個(gè)槍頭，然后傾斜插入，前后方向搖動(dòng)即可卡緊，避免用重力撞擊，吸頭卡緊后可看到連接部分形成清晰的密封圈。

6）處理大批量樣本時(shí)，首孔與末孔加樣時(shí)間間隔過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致各微孔間有不同的起始反應(yīng)時(shí)間，從而影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。為保證不同樣品的孵育時(shí)間一致，可先取待檢樣品、FDMV AC 陰性血清、FDMV AC 陽(yáng)性血清不低于10μl 分別加入96孔板中并做好記錄，然后用多道移液器移至FDMV AC 抗原包被板相應(yīng)孔中。也可在抗原包被板直接加樣。

7）微量振蕩：對(duì)微孔內(nèi)的混合溶液進(jìn)行充分混勻。將已用封口貼封閉的微孔板平穩(wěn)牢固的放置于微量振蕩器的載物平臺(tái)上，以中等檔位的力度震蕩30s。手工混勻：?jiǎn)问治瘴⒖装寮荛L(zhǎng)邊兩側(cè)，在實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)上向左右輕輕平行搖晃60s，使混合液體均勻。將已密封的微孔板放置于室溫或恒溫箱37℃中溫育反應(yīng)。

8）溫育：在溫育前將封口貼緊覆蓋在微孔板上，確保無(wú)縫隙，將密封好的微孔板放置在37℃的恒溫箱內(nèi)，為了能夠使試劑得到充分的反應(yīng)，溫育的溫度非常重要。

9）洗滌：①手工清洗微孔板內(nèi)的殘余物質(zhì)。將提前配置的洗滌液加入移液槽里，然后快速甩掉微孔板內(nèi)反應(yīng)液于廢液池內(nèi)，用300μL量程的多道移液器吸取280μL 洗滌液，在微量血凝板上方傾斜45 度以吸頭出水口對(duì)準(zhǔn)微孔逐一沖洗3～5 次（依據(jù)日常操作習(xí)慣微孔板近身端可微微平行向右偏移10°左右，更利于移液器吸頭對(duì)準(zhǔn)微孔板各孔進(jìn)行洗板），將各孔注滿洗液，靜置1min，甩掉微孔板內(nèi)洗液，按照以上步驟重復(fù)3 次。手工清洗應(yīng)注意沖洗水流的力度適中，不宜過大。洗滌時(shí)各孔均需加滿洗滌液（不能過滿，防止溢出），防止孔口有游離的物質(zhì)不能洗凈。洗板結(jié)束后必須立即拍打干凈，不可使酶標(biāo)板自然干燥。②洗板機(jī)：自動(dòng)清洗微孔板內(nèi)的殘余物質(zhì)。將提前配置的洗液加入自動(dòng)洗板機(jī)的洗液瓶里，然后快速甩掉微孔板內(nèi)反應(yīng)液于廢液池內(nèi)，使用洗板機(jī)洗板3 次，每次浸泡1min，清洗后拍干反應(yīng)板。洗板機(jī)噴水口很容易被洗液形成的結(jié)晶物堵塞，造成各孔間較大差異，因此應(yīng)當(dāng)注意按時(shí)對(duì)洗板機(jī)進(jìn)行清潔保養(yǎng)。

10）避光裝置：底物溶液B 應(yīng)避光保存，底物溶液使用時(shí)應(yīng)該現(xiàn)用現(xiàn)配，如出現(xiàn)變色，應(yīng)棄之不用。操作中應(yīng)將加入顯色劑的微孔板放置在無(wú)雜物的抽屜或盒子內(nèi)，使外部可見光無(wú)法照射到即可。

11）拍板；在清洗微孔后，將微孔板倒置在吸水紙上（一般采用的方法是無(wú)菌紗布折疊數(shù)層），單手握緊吸水紙與微孔板的側(cè)面邊緣，微孔板面向下，用力拍打，將附著在微孔壁和微孔底上的殘余液體吸附干凈（不可以將吸水紙直接放入微孔中），同時(shí)還要清除板底殘留的液體和手指印。徹底的清洗和拍干，可以提高吸光度數(shù)值讀取的精準(zhǔn)性。

12）酶標(biāo)儀讀數(shù)：讀取微孔板內(nèi)各孔液體的吸光度。濾光片應(yīng)設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm。測(cè)定結(jié)果以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，讀取結(jié)果時(shí)，應(yīng)擦干酶標(biāo)板底部，且微孔內(nèi)不能有氣泡。不要觸碰孔底部的外壁，輕微的指印和劃痕都可能影響最終的讀數(shù)。

13）通常意義上的室溫是指18～25℃的環(huán)境。如果溫差在±5℃時(shí)，應(yīng)使用空調(diào)裝置調(diào)節(jié)室內(nèi)溫度以達(dá)到試驗(yàn)要求。

14）不同批號(hào)的特異性試劑不可混用，通用試劑可以交互使用，不可以與其他廠商的試劑混用，超過有效期限的試劑不可使用。

15）所有樣品、廢液和廢棄物都應(yīng)按照傳染物處理銷毀。

綜上所述，動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)工作需要操作細(xì)致入微，儀器精準(zhǔn)可靠。既要保護(hù)操作者自身安全又確保監(jiān)測(cè)的價(jià)值。監(jiān)測(cè)是依靠正確的操作和規(guī)范，從技術(shù)的角度提取各種數(shù)據(jù)和指標(biāo)，經(jīng)過量化處理，預(yù)先對(duì)動(dòng)物疫病的種類、危害情況、病情發(fā)展情況等均予以了解，并且還可有效控制動(dòng)物疫病的發(fā)生與發(fā)展，避免出現(xiàn)動(dòng)物疫病大規(guī)模暴發(fā)情況。為后續(xù)動(dòng)物疫病防控，提供一定的參考價(jià)值和解決措施。但當(dāng)前，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展過程中，廣大養(yǎng)殖戶對(duì)動(dòng)物疫病的監(jiān)測(cè)不夠重視，需要下鄉(xiāng)入戶進(jìn)行宣傳普及知識(shí)，讓養(yǎng)殖戶對(duì)動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)有一個(gè)正確的認(rèn)識(shí)，積極采取適合自場(chǎng)的有效的監(jiān)測(cè)方案，制定適合自場(chǎng)的防疫措施，從而降低疫病發(fā)病幾率，提高疫病監(jiān)測(cè)的治療和效果，促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。