吳情 肖國岫 徐斌

[摘要]目的：本研究構(gòu)建了一種新型的牛血清白蛋白納米藥物遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)可共遞送抗腫瘤藥物，用于口腔頜面部腺樣囊性癌及其導致的轉(zhuǎn)移性肺癌的治療。方法：制備的蛋白納米顆粒負載疏水性化療藥物阿霉素（Dox），并在顆粒表面修飾腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL），以實現(xiàn)靶向共遞送治療性藥物，用于治療轉(zhuǎn)移性腫瘤。結(jié)果：本次合成的多功能納米顆粒具有較好的形貌特征和電位值。體外實驗表明，該納米遞送系統(tǒng)具備還原敏感性，在谷胱甘肽（GSH）誘導下能斷裂，并釋放出Dox，在48h后釋放率超過60%。該納米顆粒不僅可以誘導涎腺腺樣囊性癌細胞（SACC-LM）凋亡，還可以有效殺傷A549肺癌細胞，腫瘤細胞對其攝取能力顯著增強。由于牛血清白蛋白的生物相容性，納米顆?？梢栽隗w內(nèi)長效循環(huán)，在聚集到肺部后，有效減少了肺部結(jié)節(jié)的數(shù)量。結(jié)論：該納米系統(tǒng)可以有效遞送抗腫瘤藥物，具有用于治療腺樣囊性癌的潛力。

[關鍵詞]腺樣囊性癌;口腔頜面部;牛血清白蛋白;納米顆粒;化療;響應釋放

[中圖分類號]R782? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）06-0110-04

Experimental Study of Novel Protein Nanosystems in the Treatment of Adenoid Cystic Carcinoma of Oral and Maxillofacial Region

WU Qing，XIAO Guo-xiu，XU Bin

（Department of Stomatology，Shanghai Fifth People's Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200240，China）

Abstract： Objective? In this study， multifunctional bovine serum albumin nanoparticular delivery system has been developed for the co-delivery of Dox and TRAIL for Adenoid cystic carcinoma therapy. Methods? The nanoparticle was constructed with green synthesis method， which only used conjugation linker （NHS-SS-NHS） without the addition of organic solvent. Results? In the system， Dox was loaded into the synthesized albumin nanoparticle， followed by the modification with TRAIL on the surface. Importantly， the multifunctional nanoparticle was demonstrated to exhibit the reduction-responsive characteristic with over 60% Dox release under the stimulation of GSH within 48h. Besides， both SACC-LM cells and A549 cells could be induced apoptosis， while enhanced internalization of nanoparticle by SACC-LM cells was detected. The in vivo experiments validated the prolonged circulation of this system， which could also significantly decrease the number of metastatic nodules. Conclusion? The novel system could exert excellent antitumor function and exhibited certain potential in clinical application.

Key words： adenoid cystic carcinoma; oral and maxillofacial region; bovine serum albumin; nanoparticles; chemotherapy; reduction-responsive

腫瘤的轉(zhuǎn)移行為是導致死亡率持續(xù)增高的重要原因[1]，腺樣囊性癌是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一，易轉(zhuǎn)移到肺部，具有較高的致死率[2-3]。對于此類腫瘤的治療，通常以手術治療和化療為主，但效果常常不盡如人意[4]?；熕盟幬镫y以有效富集到轉(zhuǎn)移腫瘤部位，并且藥物體內(nèi)隨機分布所引起的毒副作用也成為死亡率增高的因素[5]。納米藥物遞送系統(tǒng)在腫瘤的治療方面展現(xiàn)出優(yōu)越的潛能，近年來已被廣泛用于腫瘤的治療[6-8]。白蛋白納米顆粒是一種具有良好生物相容性以及長循環(huán)能力的載體，因此得到了學界的廣泛關注[9-10]。該納米顆粒可以顯著改善藥物的毒副作用，經(jīng)體內(nèi)注射之后，顯著改善了患者的生存期，為腫瘤患者帶來了福音[11-12]。目前研究的蛋白納米顆粒治療功能單一，治療安全性也有待提高。本項目構(gòu)建了一種綠色的白蛋白負載阿霉素的納米藥物遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)不使用有機溶劑，在修飾腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）[13]，能夠協(xié)同Dox的抗腫瘤作用，從而增強腫瘤治療效果。期待納米顆?？梢赃x擇性的富集到病灶部位，并在腫瘤微環(huán)境中有效釋放藥物，殺傷腫瘤。

1? 材料和方法

1.1 主要試劑：二甲基亞砜（DMSO），牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA），阿霉素（Doxorubicin，Dox）購于阿拉丁試劑（上海）有限公司;4-（N-馬來酰亞胺基甲基）環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺（SMCC），腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）購于Sigma;NHS-SS-NHS購于西安瑞禧生物科技有限公司;磷酸鹽緩沖液（PBS），胎牛血清（FBS），RPMI 1640培養(yǎng)基，青霉素和鏈霉素，胰蛋白酶，購于Hyclone公司;其他試劑為分析純。

涎腺腺樣囊性癌細胞株（SACC-LM）由北京大學口腔醫(yī)學院提供。

1.2 BSA納米顆粒（BSA NP），載Dox顆粒（BDN）和修飾TRAIL的載Dox顆粒（TBDN）的合成：BSA NP的合成：稱取1.5mg BSA加入到100μl的PBS中，充分震蕩至BSA完全溶解。隨后，稱取NHS-SS-NHS，溶解在DMSO中，配成終濃度為10mg/ml的母液。將BSA溶液放置在室溫下以450rpm條件持續(xù)攪拌，緩慢滴加10μl新配置的NHS-SS-NHS母液，常溫反應40min，透析24h，即形成了二硫鍵交聯(lián)的BSA納米顆粒。

BDN的合成：在上述BSA NP形成過程中，加入15μl溶解在DMSO中的Dox溶液（終濃度10mg/ml），以450rpm條件持續(xù)攪拌，常溫反應40min，用超純水透析24h，即得到了BDN。

TBDN的合成：為了增加BDN的靶向性以及腫瘤殺傷作用，將TRAIL修飾到BDN表面，具體步驟如下：將合成好的BDN分散在PBS中，加入SMCC，室溫反應30min后，緩慢加入TRAIL，接著室溫反應6h，超濾（10k），即得到TBDN。

1.3 粒徑、電位以及形貌：將收集的TBDN稀釋到一定濃度，通過動態(tài)光散射儀測定水合粒徑大小以及電位值變化。將TBDN滴加到銅網(wǎng)上，使用醋酸鈾負染，通過TEM觀測納米顆粒形貌。

1.4 穩(wěn)定性測定：將TBDN分別分散在PBS和含有10% FBS的1640培養(yǎng)基中，混勻后，每隔24h取出樣品，通過DLS測定粒徑數(shù)值。

1.5 還原響應性研究：將TBDN分散在含有10mM GSH的PBS溶液中，震蕩混勻后，分別在1h和2h取出溶液用DLS測定粒徑大小。為了進一步測定在還原條件下的響應釋放行為，本實驗測定了在不同濃度GSH刺激條件下Dox的釋放情況。具體步驟如下：將TBDN分散在含有0mM，2μM和10mM GSH的PBS緩沖液中，裝于1K的透析袋中。將透析袋分別置于50ml的PBS緩沖液體系中，其中緩沖液中分別含有0mM，2μM和10mM的GSH。分別在第1、2、4、8、12、24和48h取出一定體積溶液，測定Dox含量。

Mt代表在t時刻的釋放總量，Mo代表初始的Dox含量。

1.6 體外細胞毒性研究：將細胞種植在96孔板上（1×104個/孔），加入1640全培養(yǎng)基，放在培養(yǎng)箱中（5%CO2，37℃）孵育24h，用PBS洗滌2次，加入新鮮不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，其中含有BDN與TBDN，濃度分別為2.5、5、10、20μg/ml，孵育24h，用PBS洗滌3次，加入含有20μl MTT（5mg/ml）的純培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育4h，去除培養(yǎng)基，加入DMSO 180μl，在570nm條件下測定每個孔中的吸收值。

1.7 體外腫瘤細胞攝取：為了進一步驗證Dox的細胞攝取增強，通過TBDN與SACC-LM的細胞孵育，用流式細胞儀檢測細胞吞噬納米材料后的熒光強度來闡述TBDN對轉(zhuǎn)移癌細胞的靶向能力。將SACC-LM細胞（1×105個/孔）接種于6孔板中，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，加入Dox，BDN與TNDN孵育4h，用PBS洗滌2次后，采用流式細胞術儀定量分析細胞的熒光信號強度。

1.8 體內(nèi)循環(huán)時間：為了探究Dox，BDN與TNDN的體內(nèi)動力學行為，將15只小鼠平均分為3組，通過靜脈注射Dox，BDN與TNDN（阿霉素劑量為5mg/kg）。在靜脈注射后的第1、2、4、8、12、24h，收集小鼠血樣，以800g離心分離10min。測定上清液中Dox的含量。

1.9 抗腫瘤轉(zhuǎn)移研究：構(gòu)建小鼠轉(zhuǎn)移瘤模型，即通過尾靜脈將4×106個SACC-LM細胞注射入裸鼠體內(nèi)（18～22g），將20只小鼠隨機分為4組。24h后，分別給小鼠注射PBS，Dox，BDN和TBDN（Dox劑量5mg/kg），每隔1d給藥一次，一共給藥5次。治療結(jié)束后，為了進一步評估肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，處死小鼠并取出肺部組織，計算肺部的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)數(shù)量。

1.10 統(tǒng)計學分析：采用SPSS 20.0軟件進行，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x?±s）表示，n代表組數(shù)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2? 結(jié)果

2.1 新型蛋白納米系統(tǒng)的構(gòu)建以及材料學表征測定：BSA合成過程如圖1所示，通過交聯(lián)分子NHS-SS-NHS，可以將BSA組裝成BSA納米顆粒。將疏水藥物Dox負載到BSA中，即得到了載藥的BSA納米顆粒。為了增強納米顆粒的主動靶向性以及對原位腫瘤、轉(zhuǎn)移腫瘤的殺傷能力，在BSN表面修飾了TRAIL分子，即制備了TBDN。透射電鏡結(jié)果表明納米顆粒形貌較為均一（見圖2），動態(tài)光散射儀表征顆粒的水合粒徑大概為80nm（見圖3）。進一步測定納米顆粒的Zeta電位值，BDN的Zeta電位值約為-25mV（見圖4），TBDN的電位值接近BDN，約為-24mV。將TBDN分別分散在PBS和含有10% FBS的1640培養(yǎng)基中，在連續(xù)監(jiān)測96h內(nèi)，顆粒尺寸基本不變（見圖5）。

通過DLS測定該納米顆粒在模擬體內(nèi)GSH的條件下粒徑的變化情況，如圖6所示，納米顆粒在GSH刺激1h后，粒徑快速地從82nm增大到580nm，在2h后，粒徑增加到950nm。

為了評估GSH誘導的納米顆粒體外藥物釋放，將TBDN放置在三種不同的pH值為7.4的PBS溶液中，其中分別包含0mM，2μM和10mM的GSH。GSH水平下TBDN中Dox的釋放曲線表明（見圖7），Dox在2μM的GSH中釋放受到抑制。48h后，只有不到20%的Dox被釋放。在無GSH下，Dox也有類似的釋放行為。在10mM GSH水平下，前10h內(nèi)（約50%）Dox釋放顯著增強。58%的Dox在12h內(nèi)被釋放，大約是無GSH刺激下時的4倍。在10mM的GSH環(huán)境中，約60%的藥物在48h后釋放，另兩組只有20%的藥物隨著時間的增加表現(xiàn)出持續(xù)釋放的行為。

2.2 體內(nèi)外實驗評價蛋白納米系統(tǒng)的腫瘤殺傷能力：如圖8所示，通過MTT法測定了BDN與TBDN對SACC-LM細胞A549細胞的體外毒性。當Dox濃度為10和20μg/ml時，SACC-LM細胞和A549細胞的生存率皆小于50%，而與BDN相比，TBDN表現(xiàn)出顯著增強的細胞毒性。

圖9顯示，BDN呈現(xiàn)出比Dox高的熒光強度，表明納米顆粒容易被細胞內(nèi)吞。而TBDN的強度顯著增加，約是Dox的2倍，是BDN的1.5倍。

圖10所示，在體內(nèi)循環(huán)5h后，游離的Dox在血液中基本被清除。與游離的Dox相比，BDN與TBDN顯著延長了血液循環(huán)時間。在循環(huán)4h時，TBDN的血液中的濃度大概是游離Dox的5倍。而在循環(huán)24h后，TBDN組中Dox濃度仍占約1%。

為了評估TBDN對轉(zhuǎn)移腫瘤的治療效果，對肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量進行了量化（見圖11）。PBS組肺部可見大量轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，Dox組的肺部結(jié)節(jié)數(shù)量略有減少。與Dox組相比，BDN組的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)數(shù)量減少了約30%，經(jīng)過TRAIL修飾后，TBDN可以增強腫瘤的治療，以及對轉(zhuǎn)移腫瘤的靶向，從而減少了肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。

3? 討論

涎腺腺樣囊性癌容易肺轉(zhuǎn)移，致死率高[14]?；颊呖梢詭Я錾?，但預后效果差，其治療方法常以化療為主[15]。然而，化療藥物缺少靶向性以及毒副作用使得治療效果不佳。對于轉(zhuǎn)移到肺部的腫瘤，通常也缺少有效的治療措施。利用蛋白納米給藥系統(tǒng)能夠共遞送治療性藥物，不僅可以改善藥物毒性，還可以對轉(zhuǎn)移的癌癥具有治療作用。

本研究制備的白蛋白納米遞送系統(tǒng)，具有較為均一的粒徑，并且合成的納米顆粒Zeta電位值較小，表明以BSA為基礎的納米顆粒具有良好的穩(wěn)定性。修飾TRAIL之后，納米顆粒的電位也未發(fā)生明顯變化，體外穩(wěn)定性監(jiān)測，表明該納米顆粒具有良好的儲存穩(wěn)定性。體外GSH刺激納米顆粒，在10mM GSH條件刺激下，納米顆粒可以斷裂，釋放藥物，體外有效的藥物釋放，是因為在GSH條件下納米顆粒發(fā)生了的解離和聚集。這種體外Dox釋放行為與10mM GSH中納米顆粒的快速尺寸變化一致。該體外釋放行為的數(shù)據(jù)表明，通過GSH誘導，納米顆粒中的二硫鍵被裂解，從而導致顆粒的解體。由此可見，BSA不僅能夠有效地負載Dox，而且對腫瘤相關GSH水平具有較高的敏感性，能夠顯著加速Dox的釋放。這種獨特的依賴GSH的藥物釋放體系在腫瘤細胞的按需釋放方面具有較大優(yōu)勢。

體外細胞毒性實驗結(jié)果證實了，表明了TBDN具有較強的腫瘤殺傷作用。而與BDN相比，TBDN表現(xiàn)出顯著增強的細胞毒性，這是由于TBDN表面修飾的TRAIL誘導的腫瘤凋亡，并在此基礎上內(nèi)吞入細胞后Dox釋放，進一步誘導腫瘤凋亡?？偟膩碚f，這些結(jié)果證實了，通過TRAIL和Dox的聯(lián)合，TBDN啟動的TRAIL和Dox的特異性遞送，可以有效地誘導腫瘤細胞凋亡。

由于腫瘤微環(huán)境中高表達GSH，該還原響應的BSA納米顆粒在腫瘤微環(huán)境中二硫鍵網(wǎng)絡將被打斷，納米顆粒結(jié)構(gòu)被破壞，使得Dox可以從顆粒中釋放，殺傷腫瘤。納米顆粒在GSH刺激后，粒徑快速增加，這是因為部分二硫鍵網(wǎng)絡在被GSH破壞，直至體系中出現(xiàn)了更大的聚集體，主要是因為二硫鍵交聯(lián)網(wǎng)絡徹底被打斷，并使得多肽片段出現(xiàn)熱力學的聚集。體外釋放行為的數(shù)據(jù)表明，通過GSH誘導，納米顆粒中的二硫鍵裂解，從而導致顆粒的解體。由此可見，BSA不僅能夠有效地負載Dox，而且對腫瘤相關GSH水平具有較高的敏感性，能夠顯著加速Dox的釋放。這種獨特的依賴GSH的藥物釋放體系在腫瘤細胞的按需釋放方面具有較大優(yōu)勢。

而腫瘤細胞吞噬實驗結(jié)果也表明，該納米遞送體系可以增強藥物細胞內(nèi)的遞送，為進一步釋放藥物以及起到腫瘤殺傷作用至關重要。體內(nèi)循環(huán)實驗證明了BSA納米顆?？梢匝娱LDox的血液循環(huán)時間，并且TRAIL修飾并不會影響藥物的體內(nèi)循環(huán)。相對較長的血液循環(huán)有助于在腫瘤部位以及轉(zhuǎn)移瘤部位更有效地積累。納米顆粒表面修飾的TRAIL，使得TBDN可以增強腫瘤的治療，以及對轉(zhuǎn)移腫瘤的靶向，從而減少了肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。該納米系統(tǒng)可以有效遞送藥物具有用于治療口腔腫瘤以及肺部轉(zhuǎn)移腫瘤的潛力。

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[收稿日期]2020-07-31

本文引用格式：吳情，肖國岫，徐斌.新型蛋白納米系統(tǒng)用于口腔頜面部腺樣囊性癌治療的實驗研究[J].中國美容醫(yī)學，2021，30（6）：110-113.