魏其云，甄世福，楊志軍，趙小梅，徐麗波，袁 麗，楊 娟

（1.蘭州市中醫(yī)醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；3.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

復(fù)方白鮮皮濕疹方，為蘭州市中醫(yī)醫(yī)院結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)篩選參合而成的經(jīng)驗(yàn)方，由白鮮皮、地膚子、苦參、馬齒莧、蛇床子、蒲公英、金銀花等12味藥材組成，具有清熱涼血、收濕斂瘡、止癢的功效，主要治療濕疹、濕瘡等，臨床療效確切[1-3]。方中白鮮皮具有清熱燥濕、祛風(fēng)解毒的功效，主要活性成分為白鮮堿、黃柏酮和檸檬苦素[4]；地膚子具有利尿消腫、清熱、祛濕的功效，主要活性成分為三萜皂苷及甾類化合物[5]。復(fù)方白鮮皮濕疹方目前只能以傳統(tǒng)湯劑對(duì)患者熏蒸或熱敷，其臨床使用范圍受限。為了更好地開發(fā)該方，本研究擬采用制劑新技術(shù)對(duì)該處方進(jìn)行二次開發(fā)，通過改變劑型進(jìn)一步擴(kuò)大臨床應(yīng)用范圍，增加臨床患者適用性。

Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法[6]建立非線性的數(shù)學(xué)模型，預(yù)測性好，試驗(yàn)精度高，結(jié)果直觀，適用于多因素、多水平的試驗(yàn)。目前該方法已被廣泛應(yīng)用于中藥學(xué)研究領(lǐng)域[7-11]?；诖耍狙芯恳詮?fù)方白鮮皮濕疹方的主要有效成分綠原酸、鹽酸小檗堿、白鮮堿含量的總評(píng)歸一值（OD值）[12]為主要考察指標(biāo)，以乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、溶劑倍數(shù)為考察因素，采用單因素試驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)方白鮮皮濕疹方的提取工藝[13-14]，以期為復(fù)方白鮮皮的相關(guān)制劑研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器Agilent1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；XSE205DU型電子天平（賽多利斯公司）；101-1AS型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉）；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇正基儀器有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗機(jī)（昆山舒美）。

1.2 試藥綠原酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-201817）；鹽酸小檗堿對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110822-201817）；白鮮堿對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111654-200301）；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水均為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)色譜柱：Inertsil氨基柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；甲醇-0.1%甲酸水溶液（89∶11）為流動(dòng)相；流速：1 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20 μL。在上述色譜條件下進(jìn)樣，綠原酸、鹽酸小檗堿、白鮮堿的色譜峰均按要求達(dá)到基線分離，分離度＞1.5，且其他成分與以上色譜峰之間無干擾。理論塔板數(shù)按白鮮堿峰計(jì)算均不低于5 000。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的配制 精密稱取綠原酸對(duì)照品11.04 mg、鹽酸小檗堿對(duì)照品8.01 mg、白鮮堿對(duì)照品5.03 mg，采用甲醇溶解并分別定容至10、10、5 mL容量瓶中，制得質(zhì)量濃度分別為1.104 0、0.801 0、1.006 0 mg/mL貯備液，備用。

分別精密吸取綠原酸貯備液5.0 mL、鹽酸小檗堿貯備液2.0 mL、白鮮堿貯備液1.5 mL置于同一10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液，備用。進(jìn)樣色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品溶液的HPLC圖譜

2.2.2 供試品的制備 制備工藝：按處方比例稱取適量藥材，以藥材8倍量80%的乙醇為提取溶劑，回流提取1.5 h，共提取2次，每次提取后濾過，合并濾液，冷卻，即得供試品。

供試品溶液的制備：取上述濾液10 mL，蒸干，適量甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣，色譜圖見圖2。

圖2 供試品溶液的HPLC圖譜

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 制備工藝：除金銀花、白鮮皮、蒲公英、黃柏外，按處方比例稱取其余藥材，以藥材8倍量80%的乙醇為提取溶劑，回流提取1.5 h，共提取2次，每次提取后濾過，合并濾液，冷卻，即得陰性對(duì)照。

陰性對(duì)照溶液的制備：取上述濾液10 mL，蒸干，適量甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣，色譜圖見圖3。

圖3 陰性對(duì)照溶液的HPLC圖譜

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液0.1、0.4、0.8、1.2、1.6 mL置于5 mL容量瓶中，分別加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，得線性回歸方程：Y綠原酸=23 897X+9.738 7（R=0.999 8）、Y鹽酸小檗堿=25 130X+87.942（R=0.999 6）、Y白鮮堿=5 559.1X+68.708（R=0.999 2）；結(jié)果表明綠原酸在0.01104～0.17664mg/mL、鹽酸小檗堿在0.003204～0.051 264 mg/mL、白鮮堿在0.003 018～0.048 288 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算綠原酸、鹽酸小檗堿及白鮮堿峰面積的RSD（n=6）分別為0.19%、0.06%、0.02%，說明該儀器的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下的同一供試品溶液6份，分別室溫放置0、2、4、6、8、12 h，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，求得綠原酸、鹽酸小檗堿、白鮮堿峰面積的RSD分別為0.09%、0.06%、0.05%。結(jié)果表明在12 h內(nèi)供試品溶液性質(zhì)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定6份同一樣品粉末，用甲醇30 mL，超聲提取30 min，水浴蒸干，甲醇定容至5 mL容量瓶中。按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，樣品綠原酸、鹽酸小檗堿、白鮮堿峰面積的RSD（n=6）分別為0.02%、0.03%、0.05%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取9份同一批已知含量的供試品溶液，精密加入一定量對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備9份樣品溶液，依法進(jìn)樣測定，根據(jù)“2.2.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率，綠原酸、鹽酸小檗堿、白鮮堿平均回收率分別為96.20%、95.95%、96.46%，RSD分別為1.17%、0.73%、0.49%，均小于2%，符合要求。（見表1）

表1 加樣回收率試驗(yàn)

2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果以白鮮堿、綠原酸、鹽酸小檗堿的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過考察不同溶劑倍數(shù)（6倍、8倍、10倍、12倍、14倍、16倍）、乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、提取次數(shù)（1次、2次、3次）和提取時(shí)間（1.0 h、1.5 h、2.0 h）4個(gè)因素對(duì)提取效果的影響[15]，為響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平的選擇提供依據(jù)。單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

由圖4A可知，白鮮堿的含量隨著溶劑用量的增加變化不明顯，綠原酸的含量先增高后降低，鹽酸小檗堿的含量先降低后緩慢升高。綜合考慮影響因素，最終選擇溶劑倍數(shù)6、10、12為該因素水平。

由圖4B可知，隨乙醇濃度的增加，白鮮堿和綠原酸的含量均先緩慢升高再下降，鹽酸小檗堿含量先下降再升高最后趨于平穩(wěn)。綜合考慮，最終選擇乙醇濃度50%、60%、80%為該因素水平。

由圖4C可知，綠原酸的含量隨提取次數(shù)增加而增加，白鮮堿、鹽酸小檗堿的含量隨提取次數(shù)的增加變化不大。綜合考慮，最終選擇提取次數(shù)1、2、3為該因素水平。

由圖4D可知，鹽酸小檗堿含量隨提取時(shí)間增加而增加，綠原酸和白鮮堿含量隨提取時(shí)間增加而升高，但變化不明顯。綜合考慮，最終選擇提取時(shí)間1.0、1.5、2.0 h為該因素水平。

圖4 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝

2.4.1 BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 通過前期單因素試驗(yàn)，不同因素及水平值已確定，以乙醇濃度（A）、溶劑倍數(shù)（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）為自變量，以綠原酸、白鮮堿、鹽酸小檗堿含量的OD值為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)方案，見表4。

表4 星點(diǎn)試驗(yàn)因素水平表

采用Design-Expert 8.05b軟件的星點(diǎn)設(shè)計(jì)方案安排復(fù)方白鮮皮濕疹方提取工藝條件，對(duì)白鮮皮濕疹方提取工藝進(jìn)行優(yōu)化確定，確定最佳提取工藝條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

表5 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4.2 模型擬合及方差分析 應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件，OD值為響應(yīng)值，分別對(duì)四個(gè)因素即乙醇濃度（A）、溶劑倍數(shù)（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合分析，得到回歸方程：Y=-12.205 20+0.074 857A+1.291 06B+3.681 15C+8.053 65D-2.081 88E-003AB-9.119 49E-004AC-3.531 76E-003AD+0.049 842BC-0.115 59BD-0.219 87CD-4.520 64E-004A2-0.044 506B2-0.912 86C2?；貧w模型方差分析[13]結(jié)果見表6。

由表6可知，P＜0.000 1，失擬項(xiàng)P＞0.05，說明此模型顯著高且擬合程度良好，對(duì)提取制備工藝的分析與預(yù)測可以用該模型。A和C無顯著性影響，B和D因素有顯著性影響（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，各因素對(duì)該方有效成分提取率的影響并不是單純的線性關(guān)系，對(duì)其提取工藝顯著性影響由大到小的排列順序應(yīng)為D＞B＞C＞A。

表6 方差分析

續(xù)表6：

2.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝及預(yù)測 根據(jù)回歸方程擬合模型，固定4個(gè)變量中的2個(gè)變量，利用軟件Design-Expert 8.0.6，繪制另外兩個(gè)變量對(duì)OD影響的三維響應(yīng)面圖，可以更直觀反映響應(yīng)值與各因素以及各因素之間的交互關(guān)系。（見圖5）

圖5 OD值與A、B、C、D四個(gè)因素的三維響應(yīng)面

經(jīng)Design-Expert軟件分析，最優(yōu)制備工藝為參數(shù)為：乙醇濃度50%，溶劑倍數(shù)10.86，提取時(shí)間1.96 h，提取次數(shù)2.75。根據(jù)實(shí)際運(yùn)行情況，選取乙醇濃度50%、溶劑倍數(shù)11倍，提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)3次。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)及結(jié)果按處方量稱取苦參、地膚子、蛇床子、馬齒莧、白鮮皮、蒲公英、金銀花等12味藥材3份，以所選最佳工藝提取條件進(jìn)行平行3次的驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果顯示，綠原酸、鹽酸小檗堿、白鮮堿平均含量分別為0.703%、0.241%、0.155%，綠原酸、鹽酸小檗堿、白鮮堿的OD值為11.27，與預(yù)測值11.19比較，偏差為-0.71%。結(jié)果表明該回歸模型建立合理，具有良好的預(yù)測性。

3 討 論

濕疹是由多種內(nèi)外因素引起的瘙癢劇烈的一種皮膚炎癥反應(yīng)[16]?，F(xiàn)代藥理研究表明，本處方中的有效成分綠原酸[17]和鹽酸小檗堿[18]都具有明顯的抑菌作用，且鹽酸小檗堿具有止癢功效[19]。單一指標(biāo)優(yōu)化可以根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果直接進(jìn)行判斷，而多指標(biāo)之間存在一定的交互作用，多個(gè)指標(biāo)同時(shí)處理與每個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)單獨(dú)處理得到的優(yōu)化結(jié)果具有差異性，因此我們引入總評(píng)歸一值（OD）。本研究采用數(shù)學(xué)方法將綠原酸、鹽酸小檗堿和白鮮堿3個(gè)指標(biāo)綜合考慮，對(duì)所有量化指標(biāo)進(jìn)行客觀分析，讓模型具有更好的預(yù)測性；通過單因素試驗(yàn)，考察并篩選出綠原酸、鹽酸小檗堿、白鮮堿3個(gè)有效成分作為考察指標(biāo)，并采用OD值綜合指標(biāo)數(shù)據(jù)。本研究在減少Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和減少試驗(yàn)次數(shù)的同時(shí)，可避免發(fā)生因試驗(yàn)設(shè)計(jì)點(diǎn)選取不當(dāng)而超出實(shí)際條件的情況，以此保證優(yōu)化結(jié)果的良好性。

本研究利用單因素試驗(yàn)和BBD-RSM優(yōu)化傳統(tǒng)復(fù)方白鮮皮濕疹方的制備工藝[20-21]，再經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，在最優(yōu)工藝參數(shù)下提取到的樣品有效成分含量高，且實(shí)測值與預(yù)測值有較小偏差。結(jié)果顯示Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法具有較為良好的預(yù)測性，可用于復(fù)方白鮮皮濕疹方提取工藝的優(yōu)選。