劉艷峰，段麗萍，郭艷敏，周 虎

（邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）患者最常見的微血管并發(fā)癥之一，是引發(fā)終末期腎病和糖尿病患者死亡的主要因素[1]。目前，DN早期干預主要以控制血糖和血壓、調整飲食為主，DN終末期則以血液透析或腎臟移植等腎臟替代療法為主[2]。然而血液透析可誘發(fā)心腦血管意外，腎臟移植費用高且存在排異反應，對并發(fā)癥改善效果并不顯著[3]。

病理生理學研究發(fā)現(xiàn)，DN發(fā)生發(fā)展與炎癥反應和細胞凋亡密切相關[4-5]，而內質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是炎癥反應和細胞凋亡的重要信號通路[6]。番茄紅素是自然界廣泛存在的一種類胡蘿卜素，具有較強的抗炎、抗凋亡活性，并且對ERS具有抑制作用[7-8]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)番茄紅素能夠通過抑制氧化應激對DM大鼠腎損傷起到保護作用[9]。本研究旨在探討番茄紅素對DN大鼠ERS的影響，以豐富其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物7周齡SPF級雄性SD大鼠65只，體質量210～240 g，購自河北省實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（冀）2019-003。實驗動物飼養(yǎng)于邯鄲康業(yè)制藥有限公司，動物使用許可證號：SYXK（冀）2018-004，飼養(yǎng)環(huán)境溫度25℃，相對濕度55%～65%，光照黑暗各12 h交替，分籠飼養(yǎng)1周后開展實驗。本研究經(jīng)邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會審核批準，批件號：HDZX[K]字2020-017。

1.2 藥物與試劑番茄紅素（南京澤朗生物科技有限公司，純度≥96%，批號：ZL201900837a）；四苯基丁酸（批號：SML0309）、鏈尿佐菌素（批號：024K1211）均購自美國Sigma公司；24 h尿蛋白量（UPro）試劑盒（批號：201912017）、尿素氮（BUN）試劑盒（批號：202003009）、肌酐（SCr）試劑盒（批號：202001013）均購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；TUNEL試劑盒（批號：191125）、ECL超敏發(fā)光試劑盒（批號：190825）、C反應蛋白（CRP）ELISA試劑盒（批號：200116）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（批號：191031）、白介素-1β（IL-1β）ELISA試劑盒（批號：191207）均購自南京建成生物工程研究所；糖調節(jié)蛋白78（GRP78）抗體（批號：bs-1219R）、增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）抗體（批號：bs-1630R）、核因子-κB（NF-κB）抗體（批號：bs-0465R）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12（Caspase-12）抗體（批號：bs-1105R）、β-actin抗體（批號：bs-0061R）均購自北京博奧森生物科技有限公司。高糖高脂飼料（67.5%常規(guī)飼料加20%蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇）[河北省實驗動物中心，許可證號：SYXK（冀）2018-003]。

1.3 主要儀器Sure Step Plus型血糖儀（美國強生公司）；VARIOSKANLUX型多功能酶標儀（美國Thermo Scientific公司）；BS-300型全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；CUT4062型石蠟切片機（德國SLEE公司）；DYCZ-24DN型電泳儀、DYCZ-40D型轉膜儀（北京六一生物科技有限公司）；Chem Doc XRS型凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.4 造模與分組隨機取55只SD大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，禁食禁水12 h，30 mg/kg腹腔注射濃度1%的鏈尿佐菌素，72 h后檢測血糖≥16.7 mmol/L，尿糖為+++或++++，即認定DN大鼠造模成功[10]；最終造模成功52只大鼠（造模成功率94.55%，造模過程死亡1只，未成模2只），分別剔除血糖值最高和血糖值最低各1只大鼠后，將剩余50只DN模型大鼠按血糖值分層隨機分為模型組、四苯基丁酸組、番茄紅素低劑量組、番茄紅素中劑量組、番茄紅素高劑量組，每組10只。剩余10只大鼠設為正常對照組，給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)。

1.5 實驗給藥四苯基丁酸組大鼠灌胃給予質量濃度為200 mg/mL的四苯基丁酸溶液[11]，番茄紅素低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給予質量濃度為2、4、8 mg/mL的番茄紅素溶液[12]，正常對照組和模型組大鼠均灌胃給予生理鹽水，各組大鼠灌胃給藥量均為5 mL/kg，1次/d，連續(xù)8周。

1.6 觀察指標

1.6.1 血糖水平檢測 各組大鼠均于給藥前和給藥后第7、14、28、56天通過尾靜脈采血，使用血糖儀測定血糖水平。

1.6.2 UPro和血清BUN、SCr含量檢測 末次給藥后，收集各組大鼠24 h尿液并采用磺基水楊酸法測定UPro值；末次給藥24 h后，腹腔注射水合氯醛實施麻醉，經(jīng)腹主動脈取血，2 000 r/min離心10 min取血清，通過全自動生化分析儀檢測血清BUN、SCr含量。

1.6.3 腎組織病理學檢查和腎細胞凋亡觀察 采集血液標本后，頸椎脫臼處死并取雙側腎組織，左腎置于10%甲醛溶液中固定72 h，石蠟浸潤包埋后行4 μm厚度連續(xù)切片，經(jīng)二甲苯透明和梯度乙醇脫蠟后，分別進行HE染色、TUNEL染色。（1）HE染色：梯度乙醇脫水和二甲苯透明后由中性樹膠封固，然后通過光學顯微鏡觀察腎組織病理學形態(tài)結構改變。（2）TUNEL染色：參照TUNEL試劑盒說明書進行染色處理，梯度乙醇脫水和二甲苯透明后由50%甘油封固，然后通過光學顯微鏡觀察腎細胞凋亡狀況；凋亡指數(shù)（apoptosis Index，AI）計算：每張切片取5個互不重疊的視野并分別計數(shù)視野內凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)，取平均值，AI（%）=（凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)）×100%。

1.6.4 腎組織炎癥細胞因子含量檢測 右側腎臟于冰上剪碎后，加入冷裂解液后研磨勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液，參照試劑盒說明書進行處理后，采用ELISA法，通過酶標儀檢測腎組織CRP、TNF-α、IL-1β水平。

1.6.5 腎組織蛋白表達檢測 取腎組織勻漿液，加入RIPA裂解液提取總蛋白并通過BCA法檢測總蛋白濃度，然后通過Western blotting法檢測蛋白表達：10% SDS-PAGE膠電泳行蛋白分離、濕法轉PVDF膜、5%蛋白免疫印跡封閉液室溫封閉2 h，洗膜后滴加GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-12、β-actin抗體4℃孵育12 h，洗膜后滴加二抗37℃孵育1 h，洗膜后滴加ELC發(fā)光劑后，通過凝膠成像儀顯示蛋白條帶，以β-actin為內參、通過條帶灰度值半定量GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-12相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法運用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠空腹血糖水平比較給藥前及給藥后第7、14、28、56天，模型組大鼠空腹血糖水平明顯高于正常對照組（P＜0.01）；給藥前，模型組，四苯基丁酸組和番茄紅素低、中、高劑量組大鼠空腹血糖水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。大鼠給藥前后不同時間點空腹血糖水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），即存在時間效應，四苯基丁酸組和番茄紅素中、高劑量組均如此。各組大鼠間空腹血糖水平總體比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），即存在分組效應。分組因素與時間因素存在交互效應（P＜0.01），變化趨勢相同；隨時間增加，四苯基丁酸組和番茄紅素低、中、高劑量組大鼠空腹血糖水平逐漸降低；隨番茄紅素給藥劑量的增加，空腹血糖水平逐漸降低。（見表1、圖1）。

表1 各組大鼠空腹血糖水平比較（±s，mmol/L）

表1 各組大鼠空腹血糖水平比較（±s，mmol/L）

注：F時間主效應=5.638，P時間主效應=0.002；F分組主效應=126.505，P分組主效應=0.000；F交互效應=11.704，P交互效應=0.000；與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與四苯基丁酸組比較，dP＜0.01

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg） 給藥前 第7天 第14天 第28天 第56天 F P正常對照組 10 - 5.59±0.81 5.70±0.83 5.68±0.79 5.71±0.78 5.69±0.83 0.036 0.997模型組 10 - 18.07±1.52a 17.92±1.63a 17.76±1.60a 17.80±1.65a 17.68±1.67a 0.089 0.985四苯基丁酸組 10 1 000 18.13±1.69 16.68±1.59 16.51±1.55 14.93±1.46b 14.17±1.30c 10.464 0.000番茄紅素低劑量組10 10 17.92±1.48 17.41±1.58 17.05±1.52 16.72±1.51 16.57±1.49 1.294 0.287番茄紅素中劑量組10 20 18.35±1.65 16.93±1.61 16.28±1.47b 15.10±1.38c 13.84±1.28c 13.491 0.000番茄紅素高劑量組10 40 18.06±1.74 16.57±1.63 15.16±1.24c 12.95±1.19cd 11.03±1.02cd 39.035 0.000 F 103.297 95.038 78.372 72.775 58.645 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 各組大鼠空腹血糖水平的交互效應輪廓圖

2.2 各組大鼠UPro和血清中BUN、SCr含量比較與正常對照組比較，模型組大鼠UPro和血清中BUN、SCr含量均升高（P＜0.01）；與模型組比較，四苯基丁酸組和番茄紅素中、高劑量組大鼠UPro和血清中BUN、SCr含量均降低（P＜0.01）；番茄紅素低劑量組大鼠UPro和血清中BUN、SCr含量與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；番茄紅素高劑量組大鼠UPro和血清中BUN、SCr含量與四苯基丁酸組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠UPro及血清中BUN、SCr含量比較（±s）

表2 各組大鼠UPro及血清中BUN、SCr含量比較（±s）

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）UPro（mg/24 h）BUN（mmol/L）SCr（μmol/L）正常對照組 10 - 9.58±1.37 5.36±1.04 27.15±3.52模型組 10 - 25.03±3.86a 21.37±3.95a 50.83±6.41a四苯基丁酸組 10 1 000 13.57±3.46b 11.84±2.71b 40.92±5.62b番茄紅素低劑量組10 10 22.68±4.62 18.53±4.17 46.71±5.87番茄紅素中劑量組10 20 17.49±3.81b 14.09±3.24b 40.75±5.14b番茄紅素高劑量組10 40 12.93±3.17b 10.25±2.40b 37.08±5.01b

2.3 各組大鼠腎組織病變情況比較正常對照組大鼠腎小管和腎小球形態(tài)結構均未見異常；模型組大鼠腎小管可見蛋白管型和細胞管型，間質區(qū)可見炎癥細胞浸潤，上皮細胞腫脹并呈現(xiàn)空泡變性，腎小球明顯增大，可見系膜和基底膜增生、內皮細胞泡沫樣變；與模型組比較，四苯基丁酸組和番茄紅素低、中、高劑量組大鼠腎小管和腎小球形態(tài)結構病變不同程度改善，四苯基丁酸組和番茄紅素高劑量組效果優(yōu)于番茄紅素低、中劑量組。（見圖2）

圖2 各組大鼠腎組織病理性形態(tài)結構改變（HE，×400）

2.4 各組大鼠腎細胞凋亡狀況比較經(jīng)TUNEL染色，細胞核黃褐色著色為凋亡細胞。正常對照組大鼠腎組織可見極少量凋亡細胞；模型組大鼠腎組織凋亡細胞數(shù)量明顯增多，與正常對照組比較，模型組大鼠AI升高（P＜0.01）；與模型組比較，番茄紅素低、中、高劑量組和四苯基丁酸組大鼠腎組織可見凋亡細胞數(shù)量不同程度減少，其中四苯基丁酸組和番茄紅素中、高劑量組AI降低（P＜0.01），且番茄紅素高劑量組AI明顯低于四苯基丁酸組（P＜0.05）。（見圖3、表3）

圖3 各組大鼠腎細胞凋亡狀況（TUNEL，×400）

表3 各組大鼠腎細胞AI比較（±s）

表3 各組大鼠腎細胞AI比較（±s）

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與四苯基丁酸組比較，cP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）AI（%）正常對照組 10 - 3.47±0.59模型組 10 - 52.08±6.75a四苯基丁酸組 10 1 000 16.71±3.03b番茄紅素低劑量組10 10 47.69±6.12番茄紅素中劑量組10 20 28.40±4.74b番茄紅素高劑量組10 40 13.92±2.58b c

2.5 各組大鼠腎組織炎癥細胞因子含量比較與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織CRP、TNF-α、IL-1β水平均升高（P＜0.01）；與模型組比較，四苯基丁酸組和番茄紅素中、高劑量組大鼠腎組織CRP、TNF-α、IL-1β水平均降低（P＜0.01）；番茄紅素低劑量組大鼠腎組織CRP、TNF-α、IL-1β水平與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；番茄紅素高劑量組大鼠腎組織CRP、TNF-α、IL-1β水平與四苯基丁酸組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠腎組織炎癥因子含量比較（±s）

表4 各組大鼠腎組織炎癥因子含量比較（±s）

注：與假手術組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）CRP（mg/g）IL-1β（ng/g）TNF-α（ng/g）正常對照組 10 -模型組 10 -四苯基丁酸組 10 1 000番茄紅素低劑量組10 10番茄紅素中劑量組10 20番茄紅素高劑量組10 40 40.83±5.16 11.49±1.70 42.86±5.12 187.29±30.54a 40.67±6.48a 88.25±11.47a 102.93±20.17b 21.06±3.80b 62.18±9.53b 165.91±28.05 37.46±7.11 84.92±13.75 137.35±23.64b 27.82±5.36b 68.07±10.94b 94.68±16.85b 19.35±3.42b 56.26±8.41b

2.6 各組大鼠腎組織GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-12蛋白表達比較與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-12蛋白相對表達量均升高（P＜0.01）；與模型組比較，四苯基丁酸組和番茄紅素中、高劑量組大鼠腎組織GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-12蛋白相對表達量均降低（P＜0.01）；番茄紅素低劑量組大鼠腎組織GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-12蛋白相對表達量與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；番茄紅素高劑量組大鼠腎組織GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-12蛋白相對表達量與四苯基丁酸組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見圖4、表5）

表5 各組大鼠腎組織GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-12蛋白相對表達量比較（±s）

表5 各組大鼠腎組織GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-12蛋白相對表達量比較（±s）

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

組別 動物數(shù)（只） 給藥劑量（mg/kg）GRP78/β-actin CHOP/β-actin NF-κB/β-actin Caspase-12/β-actin正常對照組 10 - 0.09±0.03 0.13±0.04 0.14±0.03 0.11±0.02模型組 10 - 1.07±0.15a 0.94±0.16a 1.16±0.18a 1.02±0.13a四苯基丁酸組 10 1 000 0.19±0.04b 0.35±0.08b 0.57±0.09b 0.29±0.06b番茄紅素低劑量組 10 10 0.98±0.17 0.81±0.17 1.08±0.17 0.91±0.12番茄紅素中劑量組 10 20 0.53±0.11b 0.60±0.13b 0.85±0.14b 0.78±0.10b番茄紅素高劑量組 10 40 0.17±0.04b 0.32±0.06b 0.61±0.10b 0.34±0.07b

圖4 各組大鼠腎組織GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-12蛋白表達Western blotting圖

3 討 論

我國DM患病人數(shù)約1.4億，其中30%～50%DM患者并發(fā)不同程度DN，已成為威脅人們生命健康的主要慢性疾病之一[13]。黃強等[14]研究發(fā)現(xiàn)高血糖刺激炎癥細胞因子大量釋放、腎細胞凋亡在DN進展過程中發(fā)揮著重要作用。因此，以抑制炎癥反應和細胞凋亡為治療靶點對抑制DN具有至關重要的作用。

番茄為藥食兩用植物，其主要活性成分番茄紅素具有良好的抗炎、抗氧化、抗凋亡、提高免疫力等生物學活性[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，DN模型大鼠腎小管可見蛋白管型和細胞管型，間質區(qū)可見炎癥細胞浸潤，上皮細胞腫脹并呈現(xiàn)空泡變性，與郭嘯華等[16]研究報道一致。給予四苯基丁酸或番茄紅素治療4周后能夠明顯降低DN大鼠空腹血糖水平，并且番茄紅素的作用具有一定的劑量依賴性和時間依賴性；給予四苯基丁酸或番茄紅素治療8周能夠明顯改善腎功能指標（降低UPro和血清BUN、SCr含量），改善腎組織形態(tài)結構病變并降低腎細胞凋亡水平，提示番茄紅素對DN大鼠腎組織損傷具有保護作用。

內質網(wǎng)是真核細胞中普遍存在的一種膜性細胞器，是調控炎癥反應、細胞凋亡的重要病理通路。龐欣欣等[17]研究發(fā)現(xiàn)，DN大鼠腎組織損傷與ERS相關。GRP78是存在于內質網(wǎng)的鈣離子伴侶蛋白，當內質網(wǎng)過度應激時將導致大量錯誤折疊和未折疊的蛋白蓄積，而誘導GRP78過度合成，因此GRP7升高可作為ERS標志檢測物。CHOP是一種促凋亡信號分子，能夠激活Caspase-12而啟動細胞凋亡，而ERS能夠誘導CHOP上調表達[18-19]。ERS能夠誘導NF-κB上調表達，而NF-κB分子中的p65亞基能夠與DNA特異位點結合而誘導單核細胞、巨噬細胞大量合成與釋放炎癥因子CRP、TNF-α、IL-1β，TNF-α、IL-1β則能夠刺激粒細胞大量合成與釋放炎癥因子，形成炎癥級聯(lián)反應[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予四苯基丁酸或番茄紅素治療8周能夠明顯下調DN大鼠腎臟組織GRP78、CHOP、Caspase-12、NF-κB表達，降低CRP、TNF-α、IL-1β含量，提示番茄紅素能夠抑制DN大鼠腎組織ERS和炎癥反應。

綜上所述，番茄紅素能夠抑制DN大鼠腎組織ERS通路及其介導的炎癥反應和細胞凋亡，這可能是番茄紅素對DN大鼠腎損傷具有保護作用的重要分子機制。