肖望重，胡 青，唐 林，戴 冰，黃 莉

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

抑郁癥是一種以悲傷、絕望、快感缺乏為主要特征，并伴有嚴重自殺傾向的情感障礙性疾病，其發(fā)病率和死亡率在逐年增加[1]。抑郁癥的病因病機復(fù)雜，目前多認為其發(fā)生發(fā)展與單胺神經(jīng)遞質(zhì)失衡、神經(jīng)突觸可塑性損傷有關(guān)，近年來抑郁癥的細胞因子假說也備受關(guān)注[2]。研究表明，慢性應(yīng)激后體內(nèi)細胞因子水平發(fā)生改變，如炎癥因子、趨化因子、生長因子等異常表達，造成神經(jīng)毒性，同時激活神經(jīng)內(nèi)分泌-下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸），進一步加重體內(nèi)炎癥等反應(yīng)，損傷海馬神經(jīng)元，導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生[3]。CX3CL1是一種特殊的趨化因子，在神經(jīng)元中廣泛表達，通過與其受體CX3CR1結(jié)合，直接調(diào)節(jié)外周和中樞神經(jīng)元興奮傳遞，并能介導(dǎo)小膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間的信號交流[4-5]。開心散是治療情志疾病的經(jīng)典名方，出自唐代孫思邈《千金要方·卷十四》，由人參、遠志、茯苓、石菖蒲四味藥物組成，全方有益氣養(yǎng)心、安神定志的功效。開心散的現(xiàn)代研究主要集中在質(zhì)量控制、制備工藝、成分及藥效研究，涉及深入分子機制的研究很少，本研究從CX3CL1-CX3CR1信號軸探討了開心散抗抑郁的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6周齡SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～200 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004，動物合格證號：1107271911005090，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級動物房，實驗期間飼養(yǎng)室溫度為（22±2）℃，相對濕度為（60±5）%，光照時間為12 h/12 h明暗交替。實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心動物倫理委員會審核通過，批準號：LLBH-201909150001。

1.2 藥物與試劑開心散由人參、遠志、茯苓、石菖蒲四味藥組成，原藥材均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，由本院藥劑科唐林藥師鑒定為正品。人參用8倍體積的70%乙醇提取2次，合并提取液，過濾，人參藥渣備用；將人參藥渣與茯苓、遠志、石菖蒲混合，加入10倍體積的水提取2次，合并藥液，濃縮，加乙醇使藥液含醇量達50%，冷藏過夜。將水提醇沉濾液與人參提取液合并，充分回收乙醇，濃縮，減壓干燥，制得浸膏，計算浸膏得率為11.4%，保存待用。氟西?。ǘY來蘇州制藥有限公司，規(guī)格：20 mg，批號：H20180015），人用劑量為每天60 mg；5-羥色胺（5-HT）ELISA試劑盒（批號：SD9540）、多巴胺（DA）ELISA試劑盒（批號：SD9563）均購自上海碧云天公司；CX3CL1抗體（批號：bs-0811R）、CX3CR1抗體（批號：bs-1728R）均購自北京博奧森；免疫組化試劑盒（武漢博士德，批號：AR1027）。

1.3 主要儀器敞箱自制；RT-6100酶標儀（深圳雷杜公司）；HS-3345全自動組織切片機（金華市華速科技有限公司）；Axio Scope A1正置熒光顯微鏡（德國Zeiss公司）；ChemiDocXRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（美國BIO-RAD公司）。

1.4 造模與分組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，進行曠場測試，根據(jù)評分值將大鼠隨機分為正常組、模型組、開心散低劑量組、開心散高劑量組、氟西汀組，每組12只。采用經(jīng)典的慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激（CUMS）方法建立大鼠抑郁模型[6-7]，應(yīng)激源包括：潮濕墊料24 h，晝夜顛倒24 h，禁水禁食24 h，夾尾1 min，4℃冰水浴5 min，80 dB噪聲12 h，束縛6 h。每天隨機采用上述1種應(yīng)激方法，7 d為1個周期，同種應(yīng)激不連續(xù)出現(xiàn)，共造模4周。造模期間大鼠均單籠飼養(yǎng)。造模完成后模型大鼠曠場實驗自主活動評分低于正常組（P＜0.05），強迫游泳實驗不動時間高于正常組（P＜0.05），即判斷造模成功。

1.5 實驗給藥大鼠在應(yīng)激造模1周后開始灌胃給藥，給藥量按照70 kg成人與200 g大鼠體表面積等效換算（成人劑量×0.018/0.2），開心散低、高劑量組大鼠給予臨床等效1倍、4倍劑量的中藥溶液（2.7、10.8 g/kg），氟西汀組大鼠給予臨床等效2倍劑量的氟西汀水溶液（10.8 mg/kg），正常組與模型組大鼠則給予等量蒸餾水，灌胃體積為10 mL/kg，連續(xù)給藥21 d。末次給藥后，所有大鼠進行行為學(xué)測試，測試完成后麻醉大鼠，部分取腦組織固定于多聚甲醛溶液中，分離部分海馬組織于液氮中凍存，轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱中備用。

1.6 觀察指標

1.6.1 行為學(xué)測試 （1）曠場測試：將大鼠放入底部均勻劃分為25個方格的自制黑色敞箱中央，待大鼠自由探索1 min后，記錄4 min內(nèi)穿越格子次數(shù)，記為自主活動評分；（2）強迫游泳實驗：將大鼠放入特制強迫游泳筒中，大鼠會劇烈掙扎以免沉落水下，記錄5 min內(nèi)的不動時間（停止游動，身體呈漂浮狀態(tài)）。

1.6.2 大鼠海馬組織5-HT和NE的含量 每組取6份大鼠海馬組織充分勻漿，離心后取上清液。按照ELISA試劑盒檢測步驟進行操作，酶標儀上讀取OD值，繪制標準曲線，計算各組大鼠海馬組織5-HT和NE的含量。

1.6.3 大鼠海馬區(qū)組織病理學(xué)改變 取6份固定充分的腦組織脫水、石蠟包埋、切片，將切片于恒溫箱中烘干，二甲苯脫蠟后置于蘇木精-伊紅染液中染色，經(jīng)脫水、透明、封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察海馬區(qū)組織病理變化情況，并進行拍照分析。

1.6.4 免疫組化法檢測海馬組織CX3CL1、CX3CR1平均光密度值 取6份腦組織脫水、包埋、切片、脫蠟，3%H2O2中室溫浸泡10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，微波爐中蒸煮進行熱抗原修復(fù)，加入5%山羊血清封閉非特異性位點，PBS洗滌，加入CX3CL1、CX3CR1一抗（1∶100）4℃冰箱中孵育過夜；洗滌，滴加二抗室溫下孵育30 min，洗滌，滴加DAB染液，蘇木素復(fù)染5 min，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，待片子晾干后拍照。使用Image-pro Plus軟件分析目的蛋白的積分光密度值。

1.6.5 Western blotting法檢測海馬組織CX3CL1、CX3CR1蛋白相對表達量 取6份海馬組織加入1 mL組織裂解液冰上裂解30 min，離心，取上清液，測定總蛋白含量。根據(jù)目的蛋白分子量制備分離膠和濃縮膠，將樣本于100℃加熱5 min使蛋白變性，每個孔道上樣50 μg，80 V恒壓SDS-PAGE電泳至溴酚藍到達分離膠底部，300 mA電流轉(zhuǎn)膜60 min，采用脫脂奶粉封閉2 h，根據(jù)分子量裁剪條帶，加入CX3CL1、CX3CR1一抗（1∶1 000）于4℃冰箱孵育過夜。一抗孵育結(jié)束后，TBST液洗滌條帶，加入HRP標記的二抗（1∶1 000）繼續(xù)孵育4 h，洗滌，化學(xué)發(fā)光法顯影。應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值，GAPDH為內(nèi)參蛋白，計算目的蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，所有計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，滿足方差齊性時，多組間均數(shù)的兩兩比較采用LSD法，不滿足方差齊性時，多組間均數(shù)的兩兩比較采用Dunnett's T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 開心散對抑郁大鼠行為學(xué)的影響與正常組比較，模型組大鼠自主活動評分明顯降低（P＜0.01），強迫游泳不動時間明顯延長（P＜0.01）；與模型組比較，開心散高劑量組和氟西汀組大鼠自主活動評分明顯升高（P＜0.01），強迫游泳不動時間明顯縮短（P＜0.01）；開心散低劑量組大鼠自主活動評分高于模型組（P＜0.05），強迫游泳不動時間與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與氟西汀組比較，開心散低劑量組大鼠強迫游泳不動時間明顯延長（P＜0.01）；開心散高劑量組大鼠自主活動評分及強迫游泳不動時間與氟西汀組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠自主活動評分和強迫游泳不動時間比較（±s）

表1 各組大鼠自主活動評分和強迫游泳不動時間比較（±s）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與氟西汀組比較，dP＞0.05，eP＜0.01

組別 動物數(shù)(只)給藥劑量 自主活動評分（分） 強迫游泳不動時間(s)正常組 12 - 55.17±11.40 10.67±5.63模型組 12 - 31.17±7.11a 52.75±11.09a氟西汀組 12 10.8 mg/kg 50.67±9.46c 19.50±6.26c開心散高劑量組12 10.8 g/kg 52.17±11.96c d 23.33±9.07c d開心散低劑量組12 2.7 g/kg 44.00±9.46b 45.25±13.53e

2.2 開心散對抑郁大鼠海馬單胺遞質(zhì)的影響與正常組比較，模型組大鼠海馬5-HT、DA含量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，開心散高劑量組和氟西汀組大鼠海馬5-HT、DA含量均明顯升高（P＜0.01或P＜0.05）；開心散低劑量組大鼠海馬5-HT、DA含量與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與氟西汀組比較，開心散低劑量組大鼠海馬5-HT含量明顯降低（P＜0.01）。（見表2）

表2 各組大鼠海馬單胺遞質(zhì)含量比較（±s，ng/mL）

表2 各組大鼠海馬單胺遞質(zhì)含量比較（±s，ng/mL）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與氟西汀組比較，dP＜0.01

組別 動物數(shù)(只)給藥劑量 5-HT DA正常組 6 - 108.10±13.20 117.20±9.38模型組 6 - 87.17±8.96a 87.28±11.07a氟西汀組 6 10.8 mg/kg 105.20±6.23c 100.10±5.65b開心散高劑量組6 10.8 g/kg 102.00±5.88b 101.50±7.37b開心散低劑量組6 2.7 g/kg 85.92±5.71d 94.83±9.03

2.3 開心散對抑郁大鼠海馬組織形態(tài)的影響HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元分布均勻，排列規(guī)則，未見明顯凋亡神經(jīng)元；模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元可見明顯凋亡，數(shù)量減少，排列不規(guī)則，胞核深染，空泡細胞多；氟西汀組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，排列相對規(guī)則，凋亡神經(jīng)元減少；開心散高劑量組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，排列整齊規(guī)則，空泡細胞及深染細胞數(shù)減少；開心散低劑量組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量有一定程度的增加，排列相對整齊，空泡細胞數(shù)較模型組減少。（見圖1）

圖1 各組大鼠海馬區(qū)組織病理學(xué)改變情況（HE，×200）

2.4 各組大鼠海馬組織CX3CL1、CX3CR1平均光密度值比較與正常組比較，模型組大鼠，海馬組織CX3CL1、CX3CR1平均光密度值顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，氟西汀組和開心散高劑量組大鼠海馬組織CX3CL1、CX3CR1平均光密度值顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）；與氟西汀組比較，開心散低劑量組大鼠海馬組織CX3CR1平均光密度值增加（P＜0.05）。（見圖2～3、表3）

表3 各組大鼠海馬CX3CL1、CX3CR1平均光密度值比較（±s）

表3 各組大鼠海馬CX3CL1、CX3CR1平均光密度值比較（±s）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與氟西汀組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)(只)給藥劑量 CX3CL1 CX3CR1正常組 6 - 0.39±0.02 0.53±0.04模型組 6 - 0.49±0.03a 0.67±0.05a氟西汀組 6 10.8 mg/kg 0.42±0.02c 0.55±0.04c開心散高劑量組 6 10.8 g/kg 0.44±0.02b 0.57±0.04c開心散低劑量組 6 2.7 g/kg 0.47±0.04 0.62±0.03d

圖2 各組大鼠海馬CX3CL1蛋白陽性表達情況（免疫組化，×200）

圖3 各組大鼠海馬CX3CR1蛋白陽性表達情況（免疫組化，×200）

2.5 各組大鼠海馬組織CX3CL1、CX3CR1蛋白表達水平比較與正常組比較，模型組大鼠海馬組織CX3CL1、CX3CR1蛋白表達顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，開心散高劑量組、氟西汀組大鼠海馬組織CX3CL1、CX3CR1蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；與氟西汀組比較，開心散低劑量組大鼠海馬組織CX3CL1、CX3CR1表達顯著增加（P＜0.01），開心散高劑量組大鼠海馬組織CX3CR1表達顯著增加（P＜0.05）。（見圖4、表4）

圖4 各組大鼠海馬CX3CL1/CX3CR1蛋白Western blotting圖

表4 各組大鼠海馬CX3CL1、CX3CR1蛋白相對表達量比較（±s）

表4 各組大鼠海馬CX3CL1、CX3CR1蛋白相對表達量比較（±s）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.01；與氟西汀組比較，dP＜0.05，eP＜0.01

組別 動物數(shù)(只)給藥劑量 CX3CL1 CX3CR1正常組 6 - 0.132±0.024 0.231±0.029模型組 6 - 0.384±0.037a 0.524±0.067a氟西汀組 6 10.8 mg/kg 0.142±0.019c 0.327±0.037c開心散高劑量組6 10.8 g/kg 0.159±0.021c 0.419±0.034cd開心散低劑量組6 2.7 g/kg 0.351±0.040e 0.451±0.049e

3 討 論

開心散是古代醫(yī)家治療情志疾病的經(jīng)驗方，由人參、遠志、茯苓、石菖蒲組成。方中人參大補元氣，安神益智；遠志寧心安神，祛痰開竅；茯苓健脾寧心；石菖蒲豁痰開竅，四味藥均有益心智、寧心神的功效，全方以補為主，標本兼顧，共奏益氣養(yǎng)心、安神定志功效。抑郁癥以情緒低落、興趣減退、學(xué)習(xí)記憶衰退為主要特征，患者表現(xiàn)為肝氣郁結(jié)、心脾兩虛、心神不寧等證候，且超過90%患者伴隨著焦慮情緒或睡眠障礙[8-9]。開心散作為寧心安神的代表方劑，是研究最為廣泛的抗抑郁中藥組方之一。目前，開心散抗抑郁藥理作用主要涉及調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)[10]、神經(jīng)營養(yǎng)[11]、褪黑素[12]、炎癥因子[13]、海馬結(jié)構(gòu)功能保護[14]等方面，尚未有從趨化性細胞因子層面探討其功效的報道。

趨化因子也稱為趨化素，是一種能夠吸引白細胞到炎癥或損傷位點的細胞因子，分為CXC（α）、CC（β）、CX3C（δ）和C（γ）4個家族。研究表明，CC和CX3C家族與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生關(guān)聯(lián)緊密，如CCL2的表達水平與抑郁癥狀呈正相關(guān)[15]，CCL3通過活化免疫細胞參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)炎癥[16]。CX3CL1是CX3C家族重要成員，其可劑量依賴性地減少大鼠的自主探索活動，引發(fā)抑郁癥狀[17]。研究表明，CX3CL1是介導(dǎo)小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元之間通訊機制的關(guān)鍵因子，其高水平表達會激活小膠質(zhì)細胞，后者是中樞的免疫細胞，激活后會持續(xù)釋放炎癥因子產(chǎn)生神經(jīng)毒性[18]。抑郁狀態(tài)下，CX3CL1與其受體CX3CR1耦聯(lián)，小膠質(zhì)細胞突起逐漸縮短消失成阿米巴狀，炎癥級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生，神經(jīng)元受損，給藥抗抑郁藥文拉法辛治療后小膠質(zhì)細胞形態(tài)恢復(fù)，CX3CR1表達降低[19]。同時也有研究表明，缺乏CX3CR1小膠質(zhì)細胞形態(tài)也會發(fā)生明顯改變，并產(chǎn)生焦慮和抑郁樣行為[20]?？梢?，CX3CL1-CX3CR1軸的平衡能夠影響小膠質(zhì)細胞的功能平衡，并對神經(jīng)元產(chǎn)生影響。在本研究中，抑郁模型大鼠海馬CX3CL1與CX3CR1表達高于正常大鼠，提示CX3CL1-CX3CR1軸處于激活狀態(tài)，并對大鼠行為表征產(chǎn)生了影響；而經(jīng)氟西汀和開心散干預(yù)后，其表達逐漸恢復(fù)平衡。

本研究發(fā)現(xiàn)，開心散能夠明顯改善抑郁模型大鼠的自主活動及行為絕望，升高海馬單胺神經(jīng)遞質(zhì)的水平，其機制與調(diào)控CX3CL1-CX3CR1軸有關(guān)。本研究從趨化因子水平探討開心散抗抑郁藥理機制，為該方的進一步開發(fā)應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。