王惠麗，鄧文喻，劉 艷，穆小萍，陳志江

（1.廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 511442；2.南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院，廣東 廣州 510280）

膿毒癥急性腎損傷（sepsis associated acute kidney injury，S-AKI）是膿毒癥患者常見的嚴重并發(fā)癥，約有50%膿毒癥患者合并急性腎功能損傷，而且合并腎損傷的患者病死率高，總體死亡率高達60%[1-2]。線粒體功能障礙是S-AKI的重要病理生理機制之一，在大鼠膿毒癥腎損傷模型中發(fā)現(xiàn)線粒體損傷后出現(xiàn)氧利用障礙，即使在微循環(huán)改善后氧輸送和氧供恢復接近正常后仍存在氧利用障礙，即線粒體呼吸窘迫（mitochondrial distress syndrome，MDS），提示線粒體是膿毒癥時器官損傷的主要靶細胞器[3-5]。線粒體不僅是細胞的能量中心，更為重要的是可組成的一個可塑性細胞器網(wǎng)絡，共同維持著多種細胞功能和過程，如活性氧水平、胞漿鈣平衡和細胞凋亡，這些病理生理過程都與膿毒癥器官損傷密切相關[6-7]。因此以線粒體功能為靶點，探索S-AKI潛在藥物的作用機制，具有現(xiàn)實意義。

槲皮素（quercetin）是一種常見的黃酮類化合物，在蔬菜、水果、紅酒及一些谷類中均可存在，是人類飲食中最主要的生物類黃酮，而且多種藥用植物中均含有此成分。槲皮素有廣泛的藥理學作用，如抗氧化、抗炎、抗纖維化、抗病毒、逆轉(zhuǎn)耐藥性等[8-10]。近年來發(fā)現(xiàn)槲皮素通過作用于線粒體生物發(fā)生、線粒體自噬參與線粒體功能調(diào)控，對線粒體電子傳遞鏈和ATP生成產(chǎn)生影響，進而影響線粒體膜電位變化，抑制線粒體誘導內(nèi)源性凋亡[11-13]。目前槲皮素與膿毒癥介導腎損傷的線粒體功能調(diào)控機制尚不明確。本研究擬通過建立S-AKI細胞模型，探索槲皮素對S-AKI線粒體功能和細胞凋亡的作用靶點與保護機制，為闡明槲皮素的腎保護作用提供實驗依據(jù)。

1 試劑與儀器

1.1 實驗材料 大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；胎牛血清（美國Gibco公司，貨號：16000044）；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司，貨號：41966-052）；胰蛋白酶（美國Gibco公司，貨號：25200-056）；噻唑藍（上海麥克林生化科技有限公司，貨號：298-93-1）；槲皮素（上海麥克林生化科技有限公司，貨號：117-39-5）；脂多糖（LPS）（美國Sigma-Aldrich，貨號：L2880）；DCFH-DA（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：S0033S）；線粒體膜電位試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：C2006）；ATP檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：S0026）；BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：P0010S）；BeyoECL Plus發(fā)光液（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：P0018S）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：P0013B）；MitoROSTM580試劑盒（美國AAT Bioquest公司，貨號：16052）；BAX抗體（Proteintech公司，貨號：50599-2-Ig）；BCL-2抗體（Proteintech公司，貨號：26593-1-AP）；GAPDH抗體（Proteintech公司，貨號：60004-1-Ig）；Gluta電鏡固定液（北京索萊寶科技有限公司，貨號：P1126）。

1.2 主要儀器 電泳儀（美國BIO-RAD公司）；離心機（美國Thermo公司）；激光共聚焦（奧林巴斯公司，F(xiàn)v10i）；熒光酶標儀（CLARIOstar Plus公司）；熒光顯微鏡觀察（奧林巴斯公司，貨號：BX63）；透射電鏡（日立H-7500）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)NRK-52E細胞培養(yǎng)條件為：含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱溫度為37℃，培養(yǎng)箱內(nèi)CO2體積分數(shù)為5%，溫度為37℃，飽和濕度為95%。約2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期的NRK-52E細胞進行實驗。細胞分組共分3組:（1）對照組：以正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；（2）LPS組：LPS 50μg/mL處理12 h；（3）LPS+槲皮素組：25μmol/L槲皮素孵育24 h后，加入LPS處理12 h。

2.2 MTT檢測細胞活力 細胞接種于96孔板，細胞密度1×104/L，每孔200μL培養(yǎng)液，細胞融合度達60%～70%，按實驗條件給予不同處理后，在生物安全柜中避光加入MTT溶液（5 mg/mL），每孔加20μL。將96孔板繼續(xù)放在培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，用注射器小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，室溫避光條件下水平搖床上緩慢搖動10 min。用多功能酶聯(lián)免疫檢測儀檢測490 nm處波長的吸光度值，結果取6個復孔的平均值，此實驗重復3次。細胞存活率=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）。

2.3 DCFH-A探針檢測細胞總活性氧（ROS）取對數(shù)生長期NRK-52E細胞，調(diào)整細胞濃度為1×105/mL接種于6孔板中，待細胞融合度達60%～70%，按實驗分組處理細胞后吸去培養(yǎng)上清，無血清培養(yǎng)基洗滌細胞兩次后，加入終濃度為10μmol/L的1∶1 000無血清稀釋的DCFH-DA，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。熒光顯微鏡下觀察ROS的強度，使用熒光酶標儀（激發(fā)波長488 nm，最大發(fā)射波長525 nm）對各組的ROS進行半定量分析。

2.4 MitoROS探針檢測線粒體（mtROS）將細胞接種于六孔板并按分組處理后無血清培養(yǎng)基洗滌2次，制備1×MitoROSTM580試劑工作溶液避光在細胞培養(yǎng)箱孵育30 min，孵育后吸去MitoROSTM580工作液，用HBSS緩沖液輕輕洗滌細胞3次。熒光顯微鏡觀察mtROS的強度，使用熒光酶標儀（激發(fā)波長540nm，最大發(fā)射波長590 nm）對各組的ROS進行半定量分析。

2.5 線粒體膜電位檢測 將細胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿，按前述方法分組處理細胞后，吸去細胞培養(yǎng)液，PBS輕輕洗滌細胞2次，分別加入1 mL JC-1染色工作液后，細胞培養(yǎng)箱里孵育20 min，孵育結束后吸除上清，用JC-1 Buffer洗滌2次，加入無血清細胞培養(yǎng)液，在激光共聚焦顯微鏡下觀察線粒體膜電位變化。

2.6 細胞ATP水平檢測 按實驗分組處理細胞后，吸去培養(yǎng)液，用預冷的PBS洗滌3次，按照說明書使用裂解液裂解細胞，然后4℃條件下離心10 min，取上清；按試劑說明書配制ATP檢測試劑后加入裂解上清液，接著室溫條件下放置5min，用移液槍吹打混勻，間隔2 s后用熒光酶標儀檢測并計算樣品ATP的濃度，同時檢測各組樣品的細胞蛋白濃度，最后進行單位換算并記錄最終結果。

2.7 透射電鏡觀察細胞線粒體形態(tài) 按實驗分組處理細胞后，吸去培養(yǎng)液，用預冷的PBS洗滌3次，加入無血清培養(yǎng)基用細胞刮刀將細胞從培養(yǎng)基皿底部刮下來，放到離心管中，以800 r/min離心3 min，棄上清，加Gluta電鏡固定液固定處理組細胞，放置于4℃冰箱固定18～24 h后，經(jīng)1%鋨酸固定后，乙醇、丙酮脫水置換，Epon812包埋劑包埋后在超薄切片機下把包埋塊切成1μm切片染色后在透射電鏡下觀察線粒體結構形態(tài)。

2.8 免疫印跡法檢查細胞凋亡相關蛋白 分組處理好的細胞用PBS輕輕洗滌后，用細胞裂解液裂解細胞，BCA試劑盒提取總蛋白并檢測各組蛋白濃度。加入Loading Buffer并煮沸保存，SDS-PAGE電泳，選擇10%分離膠和5%濃縮膠進行蛋白電泳，待電泳完畢后，選取目的蛋白分子量區(qū)域凝膠進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)至PVDF膜后用5%脫脂牛奶封閉1h，搖床孵育一抗4℃過夜，TBST洗滌后室溫下孵育二抗1 h，TBST洗滌后，用ECL化學發(fā)光法進行發(fā)光。

2.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。結果采用“均數(shù)±標準差”表示，多組間比較使用單因素方差分析。滿足方差齊，兩兩比較用LSD法；如果方差不齊，結果用Welch法進行校正，多組間的兩兩比較用Dunnett’s T3法。P〈0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 槲皮素對LPS誘導的NRK-52E細胞活力的影響MTT檢測5、10、15、25、50、75、100μmol/L槲皮素對腎小管上皮細胞細胞活力的影響，如圖1A所示，在5～25μmol/L的濃度時細胞活力與對照相比較，差異無統(tǒng)計學意義（P〉0.05），后續(xù)槲皮素實驗處理濃度采用25μmol/L進行。如圖1B所示，LPS刺激能導致NRK-52E細胞活力下降，而槲皮素預處理后，能降低LPS所導致的細胞活力下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P〈0.05）。

圖1 槲皮素對NRK-52E和LPS誘導的NRK-52E細胞活力的影響（±s）

3.2 DCFH-DA、MitoROSTM580熒光探針檢測各組NRK-52E細胞ROS、mtROS水平 如圖2A、B所示，DCFH-DA探針裝載后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光越強提示細胞內(nèi)ROS水平越高，LPS處理后細胞熒光強度顯著增高，LPS+槲皮素組細胞熒光強度較LPS組低；MitoROSTM580探針裝載后，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光越強提示細胞內(nèi)mtROS水平越高，LPS處理后細胞紅色熒光強度顯著增高，LPS+槲皮素組細胞熒光強度較LPS組低。對各組細胞ROS、mtROS水平進行定量分析結果顯示LPS組ROS、mtROS水平顯著高于對照組和LPS+槲皮素組（P〈0.05）。（見圖2C、D）

圖2 槲皮素對NRK-52E細胞ROS、mtROS及LPS誘導的NRK-52E細胞的影響

3.3 槲皮素對LPS誘導NRK-52E細胞線粒體膜電位的影響 線粒體膜電位是反應線粒體功能正常與否的重要指標之一，JC-1染色后，線粒體膜電位正常會顯示紅色熒光，反之線粒體膜電位異常會顯示綠色熒光。共聚焦顯微鏡下觀察LPS組NRK-52E細胞線粒體膜電位明顯下降，LPS+槲皮素組與LPS組比較，線粒體膜電位有所恢復。（見圖3）

圖3 槲皮素對LPS誘導NRK-52E細胞線粒體膜電位的影響

3.4 槲皮素對LPS誘導NRK-52E細胞ATP水平影響LPS組、LPS+槲皮素組細胞ATP含量均明顯低于對照組（P〈0．05）；LPS+槲皮素組細胞ATP含量明顯高于LPS組，差異有統(tǒng)計學意義（P〈0．05）。（見圖4）

圖4 槲皮素對LPS誘導NRK-52E細胞ATP水平影響

3.5 透射電鏡觀察各組細胞線粒體超微結構變化 電鏡結果顯示對照組NRK-52E細胞線粒體密度分布均勻，線粒體邊界清楚、基質(zhì)和嵴結構正常。LPS組可見線粒體密度減少、線粒體出現(xiàn)腫脹明顯、邊界不清、基質(zhì)密度降低、嵴脫落、空泡樣變，可見部分線粒體溶解現(xiàn)象。與LPS組比較，槲皮素+LPS組NRK-52E細胞線粒體損傷現(xiàn)象減輕，表現(xiàn)為線粒體密度稍增多、腫脹減輕，未見空泡樣變和溶解情況。

圖5 透射電鏡觀察各組細胞線粒體超微結構變化

3.6 槲皮素對LPS誘導的NRK-52E細胞凋亡相關蛋白的影響 與對照組比較，LPS組Bax蛋白表達水平明顯升高，Bcl-2蛋白表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P〈0．05）。與LPS組比較，LPS+槲皮素組Bax蛋白表達明顯降低，Bcl-2的表達明顯升高（P〈0．05）。（見圖6）

圖6 槲皮素對LPS誘導的NRK-52E細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2的影響

4 討 論

膿毒癥定義更新為感染引起的炎癥反應失調(diào)導致危及生命的器官功能障礙[14-15]。器官功能障礙是膿毒癥進展的核心，腎臟是膿毒癥易受損的靶器官。膿毒癥是急性腎損傷的最常見原因，占到所有病例的50%左右[1-2]。膿毒癥急性腎損傷往往是危重癥患者多器官功能障礙綜合征（MODS）的一部分，死亡率高達60%以上，另外其可增加后期出現(xiàn)慢性腎臟病的風險[1-2]。腎臟是機體內(nèi)線粒體含量第二豐富的器官，僅次于心臟，每天大約消耗機體7%的能量，線粒體的結構和功能正常對于維持腎臟功能代謝至關重要[16-17]。在經(jīng)典的LPS和盲腸結扎穿孔（CLP）膿毒癥模型中已經(jīng)證實線粒體功能出現(xiàn)明顯結構上損傷和功能障礙，出現(xiàn)線粒體腫脹、基質(zhì)透明、線粒體嵴斷裂、線粒體膜電位下降。線粒體是細胞內(nèi)重要的亞細胞器，是細胞內(nèi)的能量中心，同時參與鈣穩(wěn)態(tài)、ROS生成，以及炎癥和凋亡信號途徑，共同維持著多種細胞功能和過程。在膿毒癥時，失控的炎癥反應導致包括TNF-α、IL-1β和IL-6在內(nèi)大量細胞因子產(chǎn)生，進而導致抑制氧化磷酸化、ROS生成增加[18-19]。此外氧化應激會影響電子傳遞鏈受阻礙、膜電位崩潰、線粒體通透性開放，這些變化結果是線粒體功能障礙、結構損傷，線粒體內(nèi)組分（mtDNA、細胞色素c）釋放到胞漿進一步激活凋亡和炎癥通路[20-21]。線粒體功能障礙介導了急性腎功能損害的發(fā)生進展，因此，進一步了解通過改善線粒體作為靶點研究具有探索價值。

近年來發(fā)現(xiàn)槲皮素能參與線粒體功能調(diào)控，可對線粒體電子傳遞鏈和ATP生成產(chǎn)生影響，進而影響線粒體膜電位變化，抑制線粒體誘導內(nèi)源性凋亡[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)LPS能導致NRK-52E細胞活力下降，導致線粒體功能和結構的損傷，凋亡通路信號通路的激活，槲皮素能夠明顯抑制LPS誘導的細胞ROS和mtROS的產(chǎn)生、線粒體膜電位的下降、ATP下降，同時電鏡下觀察到線粒體結構損傷減輕，抑制凋亡信號通路的活化。

槲皮素對線粒體功能的調(diào)控可能與線粒體質(zhì)量控制有關。線粒體質(zhì)量控制（Mitochondrial quality control，MQC）是指線粒體網(wǎng)絡受到復雜的細胞內(nèi)和細胞外信號通路的密切調(diào)控，維持線粒體穩(wěn)定的重要機制，體現(xiàn)在對線粒體形態(tài)、遷移、分布、數(shù)量等方面的調(diào)控[22-23]。線粒體質(zhì)量控制主要通過一些相互關聯(lián)又相互制約的途徑來進行質(zhì)量維持，其中包括正常蛋白的生成與異常蛋白的及時降解、新舊線粒體的更替及線粒體DNA的正常合成與修復的維持等，主要涉及以下3種機制：線粒體生物發(fā)生（Mitochondrial biogenesis）、線粒體分裂與融合（Mitochondrial fission and fusion）、線粒體自噬（Mitophagy）。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠參與線粒體生物發(fā)生、線粒體自噬的調(diào)控。如LI X等[24]發(fā)現(xiàn)槲皮素可顯著減少TBI誘導的神經(jīng)元凋亡，改善線粒體損傷，顯著地加速了PGC-1a蛋白從細胞質(zhì)到細胞核，提示槲皮素能通過介導PGC-1a通路增加線粒體生物發(fā)生的活性來減輕TBI模型的腦損傷。關于槲皮素對線粒體自噬調(diào)控，LIU P Y等[25]發(fā)現(xiàn)槲皮素通過增加LC3I、Pink1、Beclin1表達來阻斷高脂飲食對線粒體自噬的抑制作用，槲皮素還能促進線粒體自噬關鍵蛋白-Parkin易位到線粒體。

綜上所述，槲皮素能夠減輕LPS所誘導的腎小管上皮細胞損傷，與恢復線粒體功能、緩解線粒體結構損害、抑制凋亡通路活化有關，為研究槲皮素防治S-AKI提供了實驗基礎，槲皮素的保護作用可能與線粒體質(zhì)量控制調(diào)控機制有關，還有待于進一步研究。