王 亞，季志紅,2，馬 璇,2，米爾扎提·麥麥提，李柯翱，張明惠

（1.新疆奇沐醫(yī)藥研究院[有限公司]，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830011）

西帕依固齦液是維吾爾族傳統(tǒng)藥物，是一種以沒食子為原料的制劑，具有健齒固齦、清血止痛的作用。西帕依固齦液用于治療牙周疾病引起的牙齒酸軟，咀嚼無力，松動(dòng)移位，牙齦出血以及口舌生瘡，咽喉腫痛，口臭煙臭[1-4]。據(jù)報(bào)道，西帕依固齦液在口腔護(hù)理中具有理想的臨床應(yīng)用價(jià)值，沒食子提取物是制備西帕依固齦液的重要中間體，影響西帕依固齦液的質(zhì)量評(píng)價(jià)[5-6]。沒食子為殼斗科植物沒食子樹（Quercus infectoria Oliv.）幼枝上的干燥蟲癭，由沒食子蜂科昆蟲沒食子蜂（Cynipsgallae-tinctoriae Oliv.）的幼蟲寄生而形成[7-9]。沒食子又名沒石子、墨石子、無食子等，主產(chǎn)于地中海沿岸、伊朗、印度等地，尤以小亞細(xì)亞產(chǎn)量最多，新疆地區(qū)所使用的沒食子多由巴基斯坦進(jìn)口，我國無分布記載，屬外來中藥[10-13]。目前，西帕依固齦液的質(zhì)量控制方法尚不完善，主要成分和活性成分的含量尚未確定，且不同提取工藝直接影響西帕依固齦液的質(zhì)量，從而無法對(duì)西帕依固齦液的質(zhì)量進(jìn)行有效監(jiān)測[14-16]。

本研究的目的是通過高效液相色譜（HPLC）法測定沒食子化學(xué)成分含量，判斷不同提取方法制備的提取物質(zhì)量是否一致[17-19]；采用化學(xué)輪廓計(jì)數(shù)結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析方法和SPSS統(tǒng)計(jì)軟件開展沒食子不同提取方法的活性成分含量差異研究，從統(tǒng)計(jì)分析角度，為不同提取方法制備的沒食子提取物的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 試劑 對(duì)照品沒食子酸（中國食品藥品檢定研究院，含量：90.8%，批號(hào)：110831-201605）；沒食子酸甲酯（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，含量：98%，批號(hào)：17092604）；沒食子酸乙酯（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，含量：98%，批號(hào)：19042902）；鞣花酸（中國食品藥品檢定研究院，含量：89.3%，批號(hào)：111959-201602）；沒食子藥材（新奇康藥業(yè)股份有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純（飛世爾實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；其他試劑均為分析純，水為純化水。

1.2 主要儀器 LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ-300VDV型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；XMTD-7000型水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；ME55型十萬分之一電子天平（德國梅特勒－托利多儀器有限公司）；ME204T型萬分之一電子天平（德國梅特勒－托利多儀器有限公司）；GM-1.0A隔膜型真空泵（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；UPT-I-20T型超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；FW135型粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

2 方 法

2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫條件，見表1；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：273 nm；進(jìn)樣量：10 μL。沒食子對(duì)照品、不同提取方法制備及處理的樣品供試液HPLC圖譜[20-21]見圖1。

表1 梯度洗脫條件

圖1 混合對(duì)照品、供試品HPLC 圖譜

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取各種對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含沒食子酸62 μg、沒食子酸甲酯26 μg、沒食子酸乙酯及鞣花酸4 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 超聲法制備的沒食子供試品溶液 分別稱取6批沒食子藥材粉末（過三號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50 mL純化水，超聲30 min，放冷，吸取1 mL，置10 mL容量瓶中，用純化水定容，即得超聲法制備的沒食子供試品溶液（A1-A6）。

2.3.2 回流法制備的沒食子供試品溶液 分別稱取6批沒食子藥材粉末（過三號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50 mL純化水，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放涼，再稱定質(zhì)量，用純化水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，吸取1 mL，置10 mL容量瓶中，用純化水定容，即得回流法制備的沒食子供試品溶液（B1-B6）。

2.4 QC樣品的制備 采用“2.3.2”回流法制備沒食子提取物供試品溶液，取續(xù)濾液作為QC樣品。

2.5 數(shù)據(jù)采集及數(shù)據(jù)處理 選擇峰A（沒食子酸）、峰B（沒食子酸甲酯）、峰C（沒食子酸乙酯）和峰D（鞣花酸）為參照對(duì)齊樣品中各色譜峰的保留時(shí)間，檢測色譜峰，形成樣品數(shù)據(jù)集（包括樣品編號(hào)、保留時(shí)間及峰面積）。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMPCA-P 13.0進(jìn)行主成分分析（PCA）、聚類分析（HCA）、秩和檢驗(yàn)等多變量數(shù)據(jù)分析，采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料若服從正態(tài)性可采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”來描述，組間比較采用方差分析，若不服從正態(tài)性可采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距來描述，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。

2.6 HPLC分析方法的驗(yàn)證 為保障6批沒食子數(shù)據(jù)的可靠性，采用QC樣品對(duì)儀器和方法的漂移程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。將QC樣品連續(xù)進(jìn)樣6次，數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMPCA-P 13.0軟件中，結(jié)果見圖2。從PCA圖中可以看出QC樣品聚為一類，顯示儀器和分析方法學(xué)的重復(fù)性和精密度較好，說明數(shù)據(jù)是可靠的，可以納入后期的數(shù)據(jù)整理。

圖2 沒食子提取物（包括QC 樣品）的PCA 圖

3 結(jié)果與分析

3.1 不同提取方法制備沒食子提取物的化學(xué)輪廓差異分析 回流法和超聲法制備的沒食子提取物樣品數(shù)據(jù)扣除QC樣品的PCA打分圖，可見沒食子提取物樣品均被清晰地分為兩大類，結(jié)果表明同一樣品用不同提取條件提取存在明顯差異；且超聲法制備的樣品更為集中，即超聲法制備樣品組內(nèi)差異小于回流法制備樣品，超聲法制得的沒食子提取物具有更高的均一性。（見圖3）

圖3 沒食子提取物樣品的PCA 打分圖

為評(píng)價(jià)樣品間質(zhì)量差異的程度，采用HCA對(duì)PCA進(jìn)行聚類分析柱狀繪圖，可以看出回流法及超聲法提取的樣品清晰的聚為2類，超聲法及回流法又分為若干類，但超聲法分類較回流法少，說明超聲法制備的樣品更為集中，組內(nèi)差異更小。結(jié)果與PCA打分圖一致，表明超聲法和回流法制備的樣品化學(xué)輪廓差異明顯，質(zhì)量差異顯著。（見圖4）

圖4 沒食子提取物樣品PCA 打分圖的HCA 分析柱圖

3.2 不同批次及不同提取方法制備的沒食子提取物主要有效成分含量變化分析 不同批次的沒食子藥材經(jīng)過超聲法和回流法提取后發(fā)現(xiàn)，回流法提取的有效成分沒食子酸和沒食子酸甲酯均明顯高于超聲法（見表2）；回流法制備的沒食子提取物中沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯的含量明顯高于超聲法（P<0.01）；而回流法制備的沒食子提取物中鞣花酸的含量則明顯低于超聲法（P<0.01）（見表3）；含量測定結(jié)果表明不同提取方法對(duì)沒食子提取物中主要有效成分含量的變化有著顯著影響，兩種提取物的質(zhì)量具有明顯差異。同時(shí)可以考慮增加沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯含量作為沒食子提取物的評(píng)價(jià)指標(biāo)?；亓鞣ㄖ苽涞臎]食子提取物3種主要有效成分含量較超聲法高。但批次間差異過大，導(dǎo)致在PCA圖上顯示回流法制得樣品較為分散。

表2 不同方法不同批次制備的沒食子提取物有效成分含量測定結(jié)果（，μg/mL，n=3）

表2 不同方法不同批次制備的沒食子提取物有效成分含量測定結(jié)果（，μg/mL，n=3）

表3 不同提取方法制備沒食子提取物的差異比較 [MCP25，P75]

4 討 論

本實(shí)驗(yàn)比較了兩種提取方法即回流法和超聲法制備的沒食子提取物的差異，發(fā)現(xiàn)兩種提取方法制備的沒食子提取物存在質(zhì)量差異，并篩選出了導(dǎo)致差異的4個(gè)特征性化學(xué)成分（沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯和鞣花酸）；結(jié)合化學(xué)輪廓及統(tǒng)計(jì)分析角度對(duì)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，從統(tǒng)計(jì)分析角度看，兩種沒食子提取物中主要有效成分沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯、鞣花酸的含量具有明顯差異（P＜0.01），回流法制備的沒食子提取物含量高于超聲法制得的樣品；化學(xué)輪廓角度分析則顯示超聲法制備的樣品有更高的均一性，因?yàn)榛亓鞣ㄌ崛〉闹饕瘜W(xué)成分含量明顯高于超聲法，所以導(dǎo)致批次間差異過大，導(dǎo)致在PCA圖上顯示回流法制備的樣品較為分散；從提取工藝與臨床應(yīng)用的相關(guān)性角度思考，回流法和超聲法制備的沒食子提取物，實(shí)際上存在質(zhì)量差異，其化學(xué)成分含量有顯著變化，這對(duì)于以沒食子提取物為原料制備生產(chǎn)的臨床應(yīng)用藥品品質(zhì)的影響不可忽視。

研究提示在生產(chǎn)以沒食子提取物為原料的藥品時(shí)，應(yīng)比較兩種提取方法制備的沒食子提取物質(zhì)量間差異及不同處理方法對(duì)其成分的影響，并與臨床實(shí)際應(yīng)用需求相結(jié)合，選擇最佳提取制備工藝，以更好地控制藥品質(zhì)量，保證臨床療效[22-23]。今后的研究將深入探討不同提取工藝如溶劑等對(duì)沒食子提取物質(zhì)量的影響，以期為沒食子提取物的質(zhì)量控制提供更為全面的科學(xué)依據(jù)。