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        基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合GEO芯片分析百合烏藥湯治療胃癌的分子靶點(diǎn)及作用機(jī)制*

        2021-11-22 07:42:12任雪童狄紫蕊付冰倩杜艷茹
        中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2021年3期
        關(guān)鍵詞:烏藥網(wǎng)絡(luò)圖百合

        任雪童,狄紫蕊,付冰倩,張 哲,杜艷茹

        (1.河北中醫(yī)學(xué)院研究生院,河北 石家莊 050091;2.河北中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,河北 石家莊 050011)

        胃癌現(xiàn)今仍然是全世界的一種重要癌癥,已成為第五位最常診斷的癌癥和第三大癌癥的死亡原因[1]。目前我國各年齡組的胃癌發(fā)病率已呈現(xiàn)出下降趨勢,全人群的發(fā)病率增長趨勢也有所緩解,但仍高于世界平均水平[2]。中醫(yī)藥治療胃癌效果越發(fā)顯著且副作用較小,采用中醫(yī)藥對胃癌防治成為一大研究熱點(diǎn),深入探索中醫(yī)藥治療胃癌的分子機(jī)制,對于胃癌患者的精準(zhǔn)治療具有重要臨床意義。

        胃癌在中醫(yī)屬“胃脘痛”“噎膈”“反胃”“心腹痞”等范疇[3]。對胃癌的病機(jī)諸家學(xué)者認(rèn)為其正氣虧虛為根本,痰、瘀、毒、邪相互搏結(jié)為基本病機(jī)[4]。百合烏藥湯首載于陳修園《時(shí)方妙用》[5],現(xiàn)代臨床中用于胃癌患者經(jīng)放療、化療后出現(xiàn)的胃陰虧虛、虛火上炎等證頗有療效[6]?,F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)百合甲醇提取物、百合總生物堿能阻滯SGC-7901細(xì)胞于G2/M期,誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡是抑制SGC-7901細(xì)胞增殖的主要機(jī)制之一[7]。

        目前對于中藥復(fù)方治療胃癌的藥效基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不明確,加之研究手段存在檢測靈敏度低等局限性,難以全面闡述藥物作用機(jī)制[8]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合公共基因芯片數(shù)據(jù)庫GEO,獲取有關(guān)正常胃黏膜與胃癌標(biāo)本的芯片,分析兩者中存在的差異表達(dá)基因,力求為胃癌腫瘤標(biāo)記物的進(jìn)一步研究提供參考。并對百合烏藥湯的主要活性成分進(jìn)行篩選,分析活性成分的作用靶點(diǎn)及生物通路,從而闡明百合烏藥湯治療胃癌可能的作用機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 藥物成分的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)中以“百合”“烏藥”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,按照口服利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18,限定物種為“Homo sapiens”為篩選條件,以得到活性成分[9]。

        1.2 藥物靶點(diǎn)的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行藥物靶點(diǎn)的收集,將所得靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niPort(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫中,校正所涉及的靶點(diǎn)信息和基因名稱。

        1.3 胃癌GEO芯片差異分析 在GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢 索“gastric cancer”,篩 選 并 下 載GSE118916芯片和平臺(tái)數(shù)據(jù),使用R軟件設(shè)定差異倍數(shù)(fold change,F(xiàn)C)絕對值>1,矯正后P值(adjPvalue)<0.05作為明顯差異基因的篩選條件,得出差異分析結(jié)果并導(dǎo)入到Excel表格中。熱圖繪制:安裝插件“packages”“pheatmap”及“Limma”包對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行二次分析,并結(jié)合P值(adjPvalue)和FC的相關(guān)數(shù)值進(jìn)行篩選,選取上調(diào)、下調(diào)最明顯的前20個(gè)基因,并定義分組(C.正常對照組,T.腫瘤組)顏色、高度等繪制熱圖?;鹕綀D繪制:設(shè)置x軸與y軸最大值,先將基因統(tǒng)一設(shè)置為無差異基因,用“黑色”表示。再通過P、logFC進(jìn)行篩選。當(dāng)P<0.05,logFC>1,表示該基因上調(diào),用“紅色”表示。當(dāng)P<0.05,logFC<1,表示該基因下調(diào),用“綠色”表示。

        1.4 治療胃癌活性成分與作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的繪制“活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”主要通過網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件Cytoscape3.2.1進(jìn)行構(gòu)建和分析。本研究將從上述“1.2”獲得的活性成分及靶點(diǎn)關(guān)系進(jìn)行導(dǎo)入以完成相關(guān)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,其中用“節(jié)點(diǎn)”(node)表示分子、靶蛋白,用“邊”(edge)表示成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系。然后采用Network analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析,以明確百合烏藥湯中較為重要的成分和靶點(diǎn),尋找重要候選基因。

        1.5 治療胃癌基因的蛋白互作和拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)主要借助BisoGenet和CytoNCA插件,其中Biso-Genet軟件主要從以下數(shù)據(jù)庫檢索:Biological General Repository for Interaction Datasets(BioGRID)、Biomolecular Interaction Network Database(BIND)、Molecular Interaction Database(MINT)、Human Protein Reference Database(HPRD)、Database of Interacting Proteins(DIP)等。設(shè)置計(jì)算度中心性(DC)>61,介度中心性(BC)>600,篩選重要基因(標(biāo)紅的基因?yàn)楹蜻x基因)。獲得的相關(guān)活性成分及靶點(diǎn)則有可能直接或間接調(diào)控這些節(jié)點(diǎn)發(fā)揮重要作用。

        1.6 治療胃癌基因GO富集分析 使用R軟件對百合烏藥湯治療胃癌的基因進(jìn)行GO富集分析。根據(jù)富集的數(shù)目和顯著程度(p value閾值<0.05,q value閾值<0.05),取前20條富集過程,分別進(jìn)行生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞成分(cellular component,CC)、基因過程(molecular function,MF)的富集,繪制柱狀圖。

        1.7 治療胃癌基因KEGG富集分析及通路網(wǎng)絡(luò)圖的繪制 使用R軟件,并安裝插件DOSE、clusterProfiler、enrichplot、colorspace、stringi、ggplot2進(jìn)行分析。根據(jù)基因富集的數(shù)目和顯著程度(p value閾值<0.05,q value閾值<0.05)進(jìn)行富集分析,取前20條KEGG通路,將得到的KEGG通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.2,根據(jù)degree值大小,繪制通路基因網(wǎng)絡(luò)圖。

        2 結(jié) 果

        2.1 百合烏藥湯活性成分與靶點(diǎn) 按照口服利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18,得到與胃癌相關(guān)的百合烏藥湯活性成分16個(gè),其中百合7個(gè),烏藥9個(gè)。Drugbank顯示成分基因373個(gè)。(見表1)

        表1 百合-烏藥主要成分

        2.2 胃癌GEO芯片差異分析GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE118916芯片與平臺(tái)文件,獲取有關(guān)正常胃黏膜與胃癌標(biāo)本的芯片,分析兩者中存在的差異表達(dá)基因。樣本中正常對照組15個(gè)樣本,腫瘤組15個(gè)樣本。利用R軟件及相關(guān)軟件包對GSE118916表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾及標(biāo)準(zhǔn)化,篩選差異基因。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn):使用R軟件設(shè)定logFC絕對值>1,矯正后P<0.05,得出正常對照組與腫瘤組差異基因1 143個(gè),分別取上調(diào)和下調(diào)最明顯的前20個(gè)基因,分析并繪制熱圖與火山圖。熱圖中橫坐標(biāo)為樣本名稱(正常對照組在前,腫瘤組在后),縱坐標(biāo)為基因名稱。綠色:低表達(dá),黑色:中表達(dá),紅色:高表達(dá)。如差異基因FNDC1在腫瘤組高表達(dá),在正常對照組低表達(dá)。(見圖1)火山圖中,橫坐標(biāo)中l(wèi)ogFC>0時(shí),表示在腫瘤組上調(diào)。logFC<0時(shí),表示在腫瘤組下調(diào)。用顏色表示為,黑色:在正常對照組與腫瘤組無差異基因;綠色:在正常對照組上調(diào),在腫瘤組下調(diào);紅色:在正常對照組下調(diào),在腫瘤組上調(diào)。(見圖2)

        圖1 正常對照組與胃癌患者差異基因熱圖

        圖2 正常對照組與胃癌患者差異基因火山圖

        2.3 百合烏藥湯治療胃癌的活性成分與作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 將百合烏藥湯與胃癌差異基因取交集后,導(dǎo)入Cytoscape3.7.2,繪制分子基因網(wǎng)絡(luò)圖,根據(jù)不同靶點(diǎn)與有效成分對應(yīng)關(guān)系的數(shù)目,進(jìn)行分類展示。共得到潛在基因靶點(diǎn)31個(gè),對應(yīng)的有效成分10個(gè)。色原酮(Nubigenol、6,7-dimethoxy-2-(2-phenylethyl)、chromone)、豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPEC)、波爾定堿(Boldine)、去甲波爾定(Norboldine)、槲皮素(quercetin)、異松脂酸(Isopimaric acid)、去甲秋水仙堿(3-Demethylcolchicine)、谷固醇(beta-sitosterol),其中對應(yīng)靶點(diǎn)較多的烏藥的活性成分槲皮素(對應(yīng)27個(gè)靶點(diǎn))及對應(yīng)活性成分較多的PTGS2(對應(yīng)8個(gè)活性成分)、ADRB2(對應(yīng)8個(gè)活性成分)可能為百合烏藥湯治療胃癌關(guān)鍵活性成分。(見圖3)

        圖3 百合烏藥湯治療胃癌分子基因網(wǎng)絡(luò)圖

        2.4 百合烏藥湯治療胃癌基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)圖 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建機(jī)體的內(nèi)在調(diào)控往往是復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),多見于直接調(diào)控靶點(diǎn)或間接調(diào)控相結(jié)合的調(diào)控方式,蛋白互作網(wǎng)絡(luò)則是為尋找直接或間接關(guān)系提供了可能[10]。將百合烏藥湯與胃癌差異基因取交集后,導(dǎo)入Cytoscape3.7.2,繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。(見圖4)在分子基因網(wǎng)絡(luò)圖的基礎(chǔ)上,使用Bisogenet和CytoNCA插件,設(shè)置計(jì)算度中心性(DC)>61,介度中心性(BC)>600,構(gòu)建拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò),共篩選出3個(gè)候選基因VCM1、HSPB1、MYC??梢奦CM1、HSPB1、MYC靶點(diǎn)位于網(wǎng)絡(luò)的核心位置,在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。(見圖5)

        圖4 百合烏藥湯靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

        圖5 百合烏藥湯治療胃癌基因拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)

        2.5 百合烏藥湯治療胃癌基因GO富集分析 使用R軟件,根據(jù)百合烏藥湯治療胃癌的基因進(jìn)行GO富集分析。根據(jù)富集條目和顯著程度,取前20條GO富集過程,分別繪制BP、CC、MF柱狀圖。GO富集分析可見,在生物過程方面,這些靶點(diǎn)涉及對脂多糖(response to lipopolysaccharide)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)(response to molecule of bacterial origin)、氧化應(yīng)激反應(yīng)(response to oxidative stress)、白細(xì)胞游走(leukocyte migration)、細(xì)胞外基質(zhì)組織(extracellular matrix organization)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織(extracellular structure organization)、對氧水平的反應(yīng)(response to oxygen levels)等生物過程,在分子功能方面,靶點(diǎn)涉及細(xì)胞因子活性(cytokine activity)、整合素結(jié)合(integrin binding)、血紅素結(jié)合(heme binding)、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性(protein kinase regulator activity)、激酶調(diào)節(jié)活性(kinase regulator activity)等分子功能。在細(xì)胞組分方面,靶點(diǎn)涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔(endoplasmic reticulum lumen)、膜筏(membrane raft)、膜微結(jié)構(gòu)域(membrane microdomain)、膜區(qū)域(membrane region)、細(xì)胞的頂端部分(apical part of cell)、膠原蛋白-包含細(xì)胞外基質(zhì)(collagen-containing extracellular matrix)等組分。(見圖6~8)

        圖6 百合烏藥湯治療胃癌基因生物過程(BP)圖

        圖7 百合烏藥湯治療胃癌基因細(xì)胞成分(CC)圖

        圖8 百合烏藥湯治療胃癌基因分子功能(MF)圖

        2.6 百合烏藥湯治療胃癌基因KEGG富集分析及基因-通路網(wǎng)絡(luò)圖 使用R軟件,根據(jù)基因富集的數(shù)目和顯著程度(p value閾值<0.05,q value閾值<0.05)進(jìn)行富集分析,共富集到34條通路關(guān)系。將KEGG通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.2,取前20條通路。根據(jù)degree值大小,顯示通路與基因的富集程度,繪制通路基因網(wǎng)絡(luò)圖。(見圖9)其中AGE-RAGE信號通路(9個(gè)靶點(diǎn)29%),腫瘤壞死因子信號通路(9個(gè)靶點(diǎn),29%),液體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化(7個(gè)靶點(diǎn),22%),IL-17信號通路(6個(gè)靶點(diǎn),19%),NF-κB信號通路(6個(gè)靶點(diǎn),19%),癌癥中miRNA(7個(gè)靶點(diǎn),22%),人類巨細(xì)胞病毒感染(6個(gè)靶點(diǎn),19%),阿米巴?。?個(gè),19%),EB病毒感染(5個(gè),16%)等信號通路,對應(yīng)的IL6、ICAM1、PRKCB、CCL2基因數(shù)目較多。

        圖9 通路與基因網(wǎng)絡(luò)圖

        3 討 論

        中國作為胃癌的高發(fā)國家,在臨床發(fā)現(xiàn)時(shí)常是中晚期,發(fā)病年齡以中老年居多[10]。隨著病程的延長,胃癌多在寒邪凝滯的基礎(chǔ)上有“癌毒”積熱的臨床表現(xiàn)[5]。一方面脾胃虛弱,氣血虧虛,使正氣虛損加重,另一方面陰虛化熱,“癌毒”更熾,形成寒熱錯(cuò)雜之證。百合烏藥湯其辨證關(guān)鍵為寒熱錯(cuò)雜,氣機(jī)失調(diào),在臨床中常加減應(yīng)用于胃癌的辨證用藥,收效甚佳[11-12]。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),從分子機(jī)制角度,闡述百合烏藥湯治療胃癌的作用機(jī)制,為進(jìn)一步研究提供理論參考。

        本研究篩選得到百合烏藥湯活性成分16個(gè),10個(gè)成分具有潛在的治療胃癌的作用。作用靶點(diǎn)較多的2個(gè)活性成分為槲皮素(27個(gè)靶點(diǎn))和豆甾醇(5個(gè)靶點(diǎn))[13-15],其中關(guān)于槲皮素、豆甾醇作用于胃癌的相關(guān)機(jī)制分析的文獻(xiàn),也證實(shí)本研究的可行性。

        構(gòu)建拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò),共篩選出3個(gè)候選基因VCM1、HSPB1、MYC。其中關(guān)于熱休克蛋白(HSP)的研究發(fā)現(xiàn),熱休克蛋白濃度升高與大多數(shù)癌癥類型的生存前景不佳有關(guān)[16]。HSP升高的意義在于其在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)特性方面的重要作用。MYC是胃癌的一種癌基因,負(fù)責(zé)細(xì)胞過度生長,促進(jìn)細(xì)胞周期調(diào)控、代謝和凋亡等基因的轉(zhuǎn)錄激活,并在胃癌中過度表達(dá)[17]。在一項(xiàng)胃癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn),MYC-調(diào)控基因的表達(dá)譜呈現(xiàn)出不同組織學(xué)亞型的胃癌細(xì)胞,在MYC調(diào)控的基因表達(dá)譜中,其共同特點(diǎn)為基因的改變,這一發(fā)現(xiàn)可能使MYC在胃癌的治療中成為一新藥靶點(diǎn)。

        GO富集分析顯示,百合烏藥湯主要涉及脂多糖、氧化應(yīng)激、血紅素結(jié)合、蛋白激酶調(diào)節(jié)等方面。脂多糖(LPS)為革蘭氏陰性桿菌外膜的組成部分,具有雙重生物學(xué)作用,作為免疫分子可以刺激機(jī)體的天然免疫反應(yīng),激發(fā)機(jī)體免疫功能,在胃癌的發(fā)展中發(fā)揮巨大作用。研究發(fā)現(xiàn)脂多糖可通過NF-κB激活促進(jìn)胃癌細(xì)胞PD-L1的表達(dá)[18]。槲皮素可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和促進(jìn)凋亡細(xì)胞死亡而抑制腫瘤的增殖。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NO生成和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(INOS)的表達(dá)[19]。并通過抑制LPS來抑制NF-κB的激活。在氧化應(yīng)激方面[20],槲皮素可增加活性氧(ROS)的產(chǎn)生,降低線粒體膜電位水平,增加AGS細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù),并通過凋亡細(xì)胞死亡降低細(xì)胞總活力。在血紅素結(jié)合方面,研究表明斛皮素可引起血紅素氧化酶-1(HO-1)mRNA和蛋白質(zhì)水平顯著升高[19]。豆甾醇則可通過抑制細(xì)胞遷移、細(xì)胞周期阻滯、線粒體介導(dǎo)凋亡和抑制JAK/STAT信號通路達(dá)到對人胃癌細(xì)胞的抗腫瘤作用[21]。

        KEGG富集通路顯示,百合烏藥湯治療胃癌主要涉及AGE-RAGE、TNF、IL-17、NF-κB等信號通路,以及癌癥中miRNA、液體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、人類巨細(xì)胞病毒感染、EB病毒感染等。其相對應(yīng)靶點(diǎn)基因以IL-6、ICAM1、PRKCB、CCL2為主。有研究發(fā)現(xiàn)IL-6是化療耐藥的關(guān)鍵因素。這些發(fā)現(xiàn)提示IL-6抑制劑的潛在治療可應(yīng)用于提高胃癌細(xì)胞對化療的反應(yīng)[22]。最新研究表明,在試圖找出調(diào)控早期胃癌(EGC)的樞紐基因的研究中發(fā)現(xiàn),ICAM1與胃癌的預(yù)后不良有關(guān),因此ICAM1可能是ECG的一個(gè)有價(jià)值的預(yù)后和診斷生物標(biāo)志物[23]。研究發(fā)現(xiàn)HSACIRC 0092306(一種新的環(huán)狀RNA)能抑制MKN-45細(xì)胞miR-197-3p表達(dá),促進(jìn)腫瘤啟動(dòng)子蛋白激酶Cβ(PRKCB)的表達(dá),從而加速胃癌的發(fā)展[24]。研究發(fā)現(xiàn)CCL2既能維持耐藥癌細(xì)胞的耐藥,又能使敏感的癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性,CCL2的敲除或自噬誘導(dǎo)成功地逆轉(zhuǎn)了腫瘤細(xì)胞的耐藥性,在化療耐藥的生物標(biāo)志物和干預(yù)靶標(biāo)上具有潛在價(jià)值[25]。在TNF-α信號通路在胃癌組織中的表達(dá)及其相互關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn),細(xì)胞存活基因可上調(diào)TNF、TNFR2、Tradd、TRAF2、CFLIP和NFKB2,而細(xì)胞凋亡的介導(dǎo)因子如TNFR1和CASP3被下調(diào)[26]。其結(jié)果表明,TNF/TNFR2結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞存活基因在GC中表達(dá)上調(diào),有利于其促腫瘤作用,而CASP3和TNFR1等促凋亡基因表達(dá)下調(diào),提示腫瘤細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖過程不平衡。這個(gè)過程也可能受到復(fù)雜的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響。EBV相關(guān)性胃癌(EBVaGC)約占胃癌全部病例的9%,EB病毒在胃癌的進(jìn)展中具有重大作用[27]。在槲皮素治療EB病毒相關(guān)性胃癌的研究中發(fā)現(xiàn),槲皮素可誘導(dǎo)SNU719細(xì)胞的凋亡,對DNMT1和DNMT3A表達(dá)的完全抑制作用明顯,提高了F啟動(dòng)子的使用頻率,降低EB病毒的潛伏期,槲皮素有可能成為抗EBV和胃癌的抗病毒和抗腫瘤藥物[28]。

        本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討百合烏藥湯治療胃癌靶點(diǎn)的相互網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,可有效顯示其有效成分與疾病靶點(diǎn)的作用機(jī)制,為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供更合理具體的指導(dǎo)。但是本研究也存在一定的局限性,藥物有效成分篩選不全面,以及部分有效成分和信號通路有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)考證。

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