畢建云，趙東升，武雪靜，張 靜

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；3.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198）

血府逐瘀湯出自清代王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，該方劑作為理血?jiǎng)┚哂谢鲋雇吹墓πАＱ痧鰷商胰?、紅花、當(dāng)歸等11味藥材組成，其功用涉及心腦血管、消化、神經(jīng)、婦科、骨科等多個(gè)系統(tǒng)[1-2]。逐瘀止痛遠(yuǎn)紅外灸貼是在原方的基礎(chǔ)上，采用一種方便實(shí)用，效果顯著的外用貼膏劑作為載體，輔助物理加熱，穴位灸貼的方式，治療原發(fā)性痛經(jīng)[2]。體外透皮性能是評(píng)價(jià)經(jīng)皮給藥制劑生物利用度高低的重要指標(biāo)，也是控制制劑質(zhì)量的重要途徑。藥物經(jīng)皮擴(kuò)散過程復(fù)雜，影響因素很多[3]。為了解逐瘀止痛遠(yuǎn)紅外灸貼的透皮吸收情況，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了體外透皮試驗(yàn)研究，對(duì)組方中有效成分芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯的透皮吸收特性進(jìn)行了考察。

1 材 料

1.1 藥物與試劑 氮酮（鄭州津北化工有限公司）；芍藥苷（批號(hào)：FY1265VX53J，供含量測(cè)定用，南通飛宇生物科技有限公司）；阿魏酸（批號(hào)：110773-201915，供含量測(cè)定用，中國食品藥品檢定研究院）；藁本內(nèi)酯（批號(hào)：181216，供含量測(cè)定用，中國藥品生物制品鑒定所）。甲醇、乙腈為色譜純，娃哈哈純凈水。

1.2 主要儀器LC-20A型液相儀（含SPD-20A紫外可見檢測(cè)器、LC-20AT泵和LC-Solution工作站，日本島津）；FA2004B電子天平（上海天美天平儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（江蘇金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠）；ZNCL-BS型恒溫磁力攪拌器（上海越眾儀器設(shè)備有限公司）；FA2004B電子分析天平（上海赫爾普國際貿(mào)易有限公司）；改良型Franz擴(kuò)散池（自制）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 正常健康7周齡SPF級(jí)健康小鼠70只，雌雄各半，體質(zhì)量18~22 g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：魯動(dòng)質(zhì)syxk（魯）20190003號(hào)。適應(yīng)性飼養(yǎng)條件：室溫保持21~24℃，濕度保持45%左右，明暗周期12 h，予以普通飼料飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。實(shí)驗(yàn)中所涉及的小鼠實(shí)驗(yàn)均經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試皮膚的制備 將小鼠背部毛用剃須刀剃毛后，脫頸椎處死，剝離整個(gè)皮膚并除去皮下脂肪組織、血管及內(nèi)膜等，用蒸餾水沖洗，再用生理鹽水反復(fù)沖洗后使用。

2.2 體外透皮實(shí)驗(yàn)研究 采用改良型Franz擴(kuò)散裝置（接受室體積為18.0 mL，接受室有效接觸面積為2.54 cm2），固定裝置。將新鮮制備好的離體鼠皮用生理鹽水洗凈，用脫脂棉吸干表面水分，將逐瘀止痛遠(yuǎn)紅外灸貼貼于皮膚表面，然后將其固定在Franz擴(kuò)散池中間，使角質(zhì)層朝向供給池。接受室加滿預(yù)溫37℃的50%乙醇生理鹽水，磁力攪拌器保持恒溫恒速。分別于2、6、8、12、16、24 h將接受液全部取出，平行4份，每次合并接受液，蒸干，用甲醇溶解并定容至1 mL，以0.45μm的微孔濾膜濾過，作為供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算累積滲透量[4-5]。

2.3 芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯透皮滲透量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 芍藥苷與阿魏酸的色譜條件：色譜柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸（15∶85）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：30℃。芍藥苷的相對(duì)保留時(shí)間為18.0 min，阿魏酸的相對(duì)保留時(shí)間為33.6 min[6-8]。

藁本內(nèi)酯的色譜條件：色譜柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（80∶20）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：325 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL。藁本內(nèi)酯的相對(duì)保留時(shí)間為8.4 min[9]。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯對(duì)照品，配成濃度分別為1.045 0、0.486 5、2.002 0μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密移取不同濃度的芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯對(duì)照品10μL，芍藥苷進(jìn)樣量分別為0.002 77、0.005 66、0.011 00、0.020 00、0.031 20、0.040 00μg；阿魏酸進(jìn)樣量分別為0.006 40、0.001 34、0.002 45、0.004 96、0.009 60、0.020 10μg；藁本內(nèi)酯進(jìn)樣量分別為0.000 56、0.001 06、0.002 58、0.004 97、0.009 56、0.040 00μg，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程分別為Y=2 323 363X+5.61，r=0.999 9；Y=37 624 211X-300.4，r=0.999 9；Y=804 264.8X+330.8，r=0.9999。結(jié)果芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯分別在0.002 77～0.040 00、0.006 40～0.020 01、0.000 56～0.040 00μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 專屬性考察 取去除赤芍、川芎、當(dāng)歸以外的其他藥材，按逐瘀止痛遠(yuǎn)紅外灸貼的制法制成缺赤芍、川芎、當(dāng)歸空白樣品，按“2.2”透皮實(shí)驗(yàn)方法操作，制成透皮24 h空白溶液。精密吸取透皮吸收供試品溶液、空白溶液、對(duì)照品溶液各10μL，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果對(duì)照品溶液與供試品溶液在相同的保留時(shí)間有相應(yīng)的峰，空白對(duì)照無干擾峰。說明該測(cè)定方法的專屬性好、無干擾。（見圖1~2）

圖1 芍藥苷和阿魏酸的HPLC圖

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一透皮吸收供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得峰面積，結(jié)果芍藥苷RSD為1.64%，阿魏酸RSD為1.16%，藁本內(nèi)酯RSD為0.96%。表明儀器精密度良好。

圖2 藁本內(nèi)酯的HPLC圖

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一透皮吸收供試品溶液，按0、2、4、8、12、24 h分別進(jìn)樣，測(cè)定色譜峰面積，結(jié)果芍藥苷RSD為1.66%，阿魏酸RSD為1.61%，藁本內(nèi)酯RSD為0.91%。表明樣品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 采用“2.2”項(xiàng)下體外透皮實(shí)驗(yàn)方法，制備6份24 h透皮吸收液分別進(jìn)樣，測(cè)定色譜峰面積，計(jì)算24 h芍藥苷、阿魏酸及藁本內(nèi)酯的透過量，結(jié)果芍藥苷RSD為1.78%，阿魏酸RSD為1.61%，藁本內(nèi)酯RSD為1.02%。表明該體外透皮實(shí)驗(yàn)方法可行。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取芍藥苷16.110 mg、阿魏酸7.988 mg、藁本內(nèi)酯3.530 mg，精密稱定，分別置于20 mL容量瓶中，用50%乙醇生理鹽水溶解并定容，搖勻，制備對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取適量上述對(duì)照品儲(chǔ)備液制成每毫升含芍藥苷16.79、33.57、40.30μg；阿魏酸8.32、16.64、19.9μg；藁本內(nèi)酯3.678、7.355、8.825μg的對(duì)照品溶液。精密量取上述3種對(duì)照品溶液2.0 mL，各3份，精密加入空白基質(zhì)，按照“2.2”項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法制備透皮24 h的樣品，按照“2.3.1”項(xiàng)下的測(cè)定方法記錄色譜圖，計(jì)算含量，測(cè)定回收率。結(jié)果可知芍藥苷的平均回收率為97.15%，RSD為1.05%；阿魏酸的平均回收率為96.83%，RSD為0.86%；藁本內(nèi)酯的平均回收率為96.60%，RSD為0.58%。說明方法回收率良好，符合要求。（見表1）

表1 3種成分回收率試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表1：

2.4 氮酮用量和接收介質(zhì)的考察

2.4.1 氮酮用量的考察 逐瘀止痛遠(yuǎn)紅外灸貼制備過程中，選擇加入0、1%、3%、5%的氮酮溶液，以芍藥苷、阿魏酸及藁本內(nèi)酯Q24及增滲倍數(shù)為考察指標(biāo)，篩選氮酮的加入量[10]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，氮酮對(duì)芍藥苷、阿魏酸及藁本內(nèi)酯均有一定的促透作用，3%氮酮對(duì)三者的促透作用均優(yōu)于5%的氮酮，綜合促透效果及經(jīng)濟(jì)效益最終選擇3%氮酮為宜。（見表2）

表2 氮酮用量的考察（μg/cm2）

2.4.2 接受介質(zhì)的選擇 選擇以生理鹽水30%、50%、70%的生理鹽水乙醇溶液為透皮接受液，以芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯的Q24為考察指標(biāo)，篩選最適宜的接受介質(zhì)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，選擇50%生理鹽水乙醇溶液為宜。（見表3）

表3 接收介質(zhì)的考察（μg/cm2）

2.5 透皮吸收滲透動(dòng)力學(xué)模型擬合 按照“2.2”項(xiàng)下的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別在1、2、6、8、12、16、24 h將接受液全部取出，平行4份，每次合并接受液，接受液蒸干，用甲醇溶解并定容至1 mL，再用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，測(cè)定接收液中芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯的濃度，計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的累積透過量，并進(jìn)行方程擬合[11-12]。

累積透過量Q對(duì)t1/2進(jìn)行回歸，得線性方程分別為芍藥苷：Q=1.258t1/2-3.392，r=0.990 9；阿魏酸：Q=0.605t1/2-1.627，r=0.996 1；藁本內(nèi)酯：Q=0.252t1/2-0.401，r=0.996 6。即三者的Q與t1/2均具有相關(guān)性。說明三者從逐瘀止痛遠(yuǎn)紅外灸貼中向離體小鼠皮膚滲透符合Higuich方程，均具有較好的體外透皮性能。芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯的Q24分別為26.429、13.103、5.790μg/cm2。以時(shí)間t為橫坐標(biāo)，各時(shí)刻芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯Q24為縱坐標(biāo)，繪制逐瘀止痛遠(yuǎn)紅外灸貼的經(jīng)皮滲透曲線，由圖可以看出，3種成分的透皮量藁本內(nèi)酯<阿魏酸<芍藥苷，這也與各成分的提取量有關(guān)。（見圖3）

圖3 芍藥苷、阿魏酸及藁本內(nèi)酯經(jīng)皮滲透曲線圖

3 討 論

影響藥物透皮吸收的因素主要來自藥物、給藥系統(tǒng)和皮膚3個(gè)方面。藥物本身的性質(zhì)是決定藥物透皮透過速率的主要因素，但同時(shí)藥物透皮吸收也受藥物在給藥系統(tǒng)中的分散狀態(tài)、系統(tǒng)中介質(zhì)對(duì)藥物的親和力及皮膚差異等條件的制約。藥物相對(duì)分子質(zhì)量＜400、油水分配系數(shù)（以正丁醇-水為分配體系測(cè)得）的對(duì)數(shù)值（lgP）1～4為宜，一般認(rèn)為藥物的油/水分配系數(shù)大，脂溶性大的藥物易溶解在角質(zhì)層，并易擴(kuò)散通過。芍藥苷（分子量：480）、阿魏酸（分子量：194）及藁本內(nèi)酯（分子量：190，lgP=2.64±0.06）中后兩者具有較好的透皮性能，但是研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷也具有較好的皮膚透過性。有研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷在慢性壓迫性損傷大鼠中，可通過調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路緩解神經(jīng)性疼痛；阿魏酸可以抑制磷脂酶A2（PLA2），從而阻止花生四烯酸的游離，阻斷生成血栓素A2（TXA2），從而抑制血小板聚集與釋放，具明顯的抗血栓作用。藁本內(nèi)酯對(duì)縮宮素所致正常雌性小鼠子宮平滑肌劇烈收縮具有明顯的拮抗作用，可使小鼠扭體反應(yīng)的潛伏期縮短，次數(shù)減少，顯示其對(duì)實(shí)驗(yàn)性痛經(jīng)模型小鼠具有鎮(zhèn)痛作用[13-14]。

在促滲劑的選擇中，氮酮安全價(jià)廉易得，并且不與貼膏中的其他藥用成分產(chǎn)生反應(yīng)，所以成型中作為首選。研究過程中也考察過桉葉油，但是無論是成型還是對(duì)芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯的促透方面都不及氮酮，因此最終確定氮酮作為促透劑。按成型工藝確定的方法，在逐瘀止痛遠(yuǎn)紅外灸貼混合稠膏中加入設(shè)計(jì)量的氮酮，使氮酮占總膏體的量分別為0、1%、3%、5%制得不同氮酮含量的貼膏，發(fā)現(xiàn)氮酮含量為3%時(shí)芍藥苷、阿魏酸及藁本內(nèi)酯的Q24較大，加入5%氮酮三者的Q24反而下降，這就表明氮酮的促透作用與其濃度有一定關(guān)系，但又不完全為劑量依賴性，對(duì)于不同的藥物要選擇其最佳的促透濃度。這也符合文獻(xiàn)中氮酮的促透規(guī)律。同時(shí)處方中的揮發(fā)油也有較好的促滲作用，并且可能與氮酮促滲作用機(jī)制相似，都是作用于角質(zhì)層的脂質(zhì)雙分子層，干擾脂質(zhì)分子的有序排列，增加脂質(zhì)的流動(dòng)性，有助于藥物分子的擴(kuò)散[15]。