李秀文，李達(dá)麗

（新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000）

慢性腎衰竭是由于長(zhǎng)期腎實(shí)質(zhì)慢性、進(jìn)行性的損傷導(dǎo)致的腎小球?yàn)V過(guò)率降低，由此引起腎臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及代謝功能發(fā)生紊亂而導(dǎo)致的一種臨床綜合征，是各種慢性腎臟疾病的最終結(jié)局，進(jìn)而逐漸導(dǎo)致機(jī)體各器官功能衰竭而嚴(yán)重危及生命安全[1-4]。目前腎臟替代治療在慢性腎衰竭的治療中發(fā)揮了重要的作用[5]，但是在進(jìn)行腎臟替代治療前如何采取有效治療措施延緩腎衰竭進(jìn)展，保護(hù)殘存的腎臟功能具有至關(guān)重要的意義。炎癥是慢性腎衰竭重要的始動(dòng)因素，持續(xù)的微炎癥狀態(tài)，促進(jìn)了腎臟的纖維化及腎臟損傷，推動(dòng)了腎衰竭的進(jìn)展[6]。木犀草素是天然的黃酮類化合物，廣泛存在于許多天然植物中，包括菊花、薄荷、迷迭香、百里香、松柏植物和蕨類植物等，具有抗氧化、抗菌、抗炎癥等作用[7-8]，但是其對(duì)慢性腎衰竭是否具有保護(hù)作用的研究還較少，為此本研究擬探討木犀草素對(duì)慢性腎衰竭大鼠的保護(hù)作用，并研究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6~8周齡SPF級(jí)Wistar健康雄性大鼠30只，體質(zhì)量160~180 g，購(gòu)于卡文斯百格（蘇州）模式動(dòng)物研究有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0002，所有大鼠于18~24℃通風(fēng)良好的SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：LFYLLSC20191209-01。

1.2 藥物與試劑 木犀草素（成都普利斯生物科技有限公司，貨號(hào)：M-007，含量＞98%）；羧甲基纖維素鈉（山東森美生物科技有限公司生產(chǎn)，貨號(hào)：FL20）；腺嘌呤（美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：A8626）；白介素-6（IL-6）試劑盒（貨號(hào)：ml102828）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（貨號(hào)：ml-002859）、尿素氮（BUN）試劑盒（貨號(hào)：ml-01049）、血肌酐（SCr）試劑盒（貨號(hào)：ml058879）（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；兔抗TLR4單克隆抗體（貨號(hào)：14358）、兔抗p-p65單克隆抗體（貨號(hào)：3031）、兔抗p-IκB單克隆抗體（貨號(hào)：76041）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，貨號(hào)：2118）、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（貨號(hào)：7074）（美國(guó)CST公司）。木犀草素使用時(shí)加入羧甲基纖維素鈉溶液配制成200、50 mg/kg混懸液。腺嘌呤使用時(shí)加入雙蒸水配制成2.5%混懸液，放置在溫度為4℃的冰箱當(dāng)中，混合均勻方可使用。

1.3 主要儀器DHG-9003型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海姚氏儀器設(shè)備廠）；LUX酶標(biāo)儀、PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)及定量PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)賽默飛公司）；移液槍、高速低溫離心機(jī)（長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.4 造模與分組 隨機(jī)選取21只大鼠進(jìn)行慢性腎衰竭模型建立：配制2.5%的腺嘌呤混懸液，以200 mg/（kg·d）的劑量對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃，連續(xù)30 d，建立大鼠慢性腎衰竭模型[9]；另取9只大鼠作為對(duì)照組，用生理鹽水灌胃，于第30天隨機(jī)選擇3只對(duì)照組大鼠和3只模型大鼠處死，通過(guò)HE染色法觀察大鼠腎組織病理變化，從而判斷造模是否成功。造模成功后將18只大鼠隨機(jī)分為模型組、木犀草素高劑量組、木犀草素低劑量組，每組6只。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 木犀草素高、低劑量組大鼠分別用200、50 mg/kg木犀草素混懸液灌胃[10]，對(duì)照組和模型組大鼠用生理鹽水灌胃，持續(xù)灌胃15 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 大鼠行為學(xué)觀察 給藥期間持續(xù)觀察各組大鼠飲食飲水狀態(tài)、大小便情況、體態(tài)、行動(dòng)狀況、毛發(fā)顏色、毛發(fā)濃密情況；記錄造模期間各組大鼠的死亡情況。

1.6.2 ELISA法檢測(cè)大鼠血清IL-6、TNF-α、BUN、SCr含量 第15天給藥1 h以后，將大鼠按體質(zhì)量0.01 mL/g注射1%的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，取麻醉后的大鼠腹主動(dòng)脈血5 mL，按照3 000 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，離心時(shí)間為15 min，離心取血清，采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清IL-6、TNF-α、BUN、SCr含量。

1.6.3 HE染色觀察大鼠腎臟組織病理變化 各組大鼠分別脫頸處死，各取出部分腎組織，將腎組織分別用體積百分比為4%的多聚甲醛固定，石蠟包理，5μm厚連續(xù)切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后光鏡下觀察腎組織病理形態(tài)變化。

1.6.4 Western blotting法檢測(cè)大鼠腎臟組織中TLR4、p-p65、p-IκB蛋白表達(dá)水平 將蛋白樣品解凍以后，加等體積的2×SDS上樣緩沖液，在100℃溫度中煮沸5 min以達(dá)到蛋白變性的目的，然后按照40μg/孔進(jìn)行加樣，采用SDS/PAGE凝膠電泳法進(jìn)行電泳，將其轉(zhuǎn)移到PVDE膜，對(duì)膜進(jìn)行封閉處理，然后加入兔抗大鼠TLR4一抗（稀釋度1∶200），放置在4℃恒溫環(huán)境中，放置過(guò)夜，再加入稀釋度為1∶10 000的二抗，放置在室溫環(huán)境中2 h，然后采用顯色劑進(jìn)行顯色，顯色時(shí)間為1 min，隨后用蒸餾水進(jìn)行洗滌，采集圖像并保存，采用凝膠圖像分析成像系統(tǒng)進(jìn)行相關(guān)分析，將GAPDH作為內(nèi)參，TLR4和GAPDH面積光密度比值代表TLR4蛋白表達(dá)情況。p-p65、p-IκB蛋白表達(dá)水平檢測(cè)方法同TLR4。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩之間的比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠行為學(xué)觀察 對(duì)照組大鼠體型圓潤(rùn)，動(dòng)作靈敏，毛發(fā)細(xì)密有光澤，飲食及大小便正常，無(wú)死亡；模型組大鼠形態(tài)消瘦，動(dòng)作遲緩，出現(xiàn)脫毛，且毛發(fā)粗糙無(wú)光，不思飲食，尿量較少，大便較稀，死亡2只；木犀草素低劑量組大鼠行為學(xué)與模型組無(wú)明顯差別，死亡1只；木犀草素高劑量組大鼠體型正常，比對(duì)照組大鼠動(dòng)作略微遲緩，毛發(fā)暗淡，并無(wú)脫毛現(xiàn)象，飲食正常，大便較稀，無(wú)死亡情況。存在大鼠死亡的組別均選取相應(yīng)數(shù)量大鼠在相同條件下進(jìn)行重新造模和給藥補(bǔ)足數(shù)量。

2.2 各組大鼠血清BUN、Scr含量比較 與對(duì)照組比較，模型組及木犀草素低、高劑量組大鼠血清中BUN和Scr含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，木犀草素高劑量組大鼠血清中BUN和Scr含量明顯下降（P＜0.05）；木犀草素低劑量組大鼠血清中BUN和Scr含量與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)表1）

表1 各組大鼠血清BUN和Scr含量比較（±s）

表1 各組大鼠血清BUN和Scr含量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）BUN（mmol/L）Scr（μmol/L）對(duì)照組 6 - 6.93±0.44 37.02±1.23模型組 6 - 17.28±0.71a 180.83±9.26a木犀草素低劑量組6 50 16.55±0.69a 176.60±10.05a木犀草素高劑量組6 200 11.47±0.86a b 92.02±10.39a b

2.3 各組大鼠血清IL-6、TNF-α含量比較 與對(duì)照組比較，模型組及木犀草素低、高劑量組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，木犀草素高劑量組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量明顯下降（P＜0.05）；木犀草素低劑量組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)表2）

表2 各組大鼠血清IL-6和TNF-α含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清IL-6和TNF-α含量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）IL-6（ng/L）TNF-α（ng/L）對(duì)照組 6 - 21.72±3.29 29.50±3.48模型組 6 - 61.24±4.49a 76.46±6.24a木犀草素低劑量組 6 50 58.61±3.56a 72.33±5.72a木犀草素高劑量組 6 200 38.99±3.32ab 42.54±3.93ab

2.4 各組大鼠腎臟組織病理變化 對(duì)照組大鼠腎臟體積正常，顏色為正常的深紅色；模型組大鼠腎臟組織體積增大，蒼白無(wú)血色，大量炎性浸潤(rùn)，間質(zhì)纖維化，腎小囊腔擴(kuò)張嚴(yán)重；木犀草素高劑量組大鼠腎臟組織炎性浸潤(rùn)較少，腎小囊腔呈現(xiàn)輕度擴(kuò)張，間質(zhì)纖維化程度較輕，腎臟組織有血色；木犀草素低劑量組大鼠腎臟病理情況與模型組基本一致。（見(jiàn)圖1）

圖1 各組大鼠腎臟組織病理變化（HE，×200）

2.5 各組大鼠腎組織TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 與對(duì)照組比較，模型組及木犀草素低、高劑量組大鼠腎臟組織TLR4、p-p65、p-IκB蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，木犀草素高劑量組大鼠腎臟組織中TLR4、p-p65、p-IκB蛋白表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05）；木犀草素低劑量組大鼠腎臟組織TLR4、p-p65、p-IκB蛋白表達(dá)水平與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)圖2、表3）

圖2 各組大鼠腎組織TLR4、p-p65及p-IκB蛋白電泳條帶

表3 各組大鼠腎組織TLR4、p-p65及p-IκB蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠腎組織TLR4、p-p65及p-IκB蛋白表達(dá)比較（±s）

注:與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）TLR4 p-p65 p-IκB對(duì)照組 6 - 0.10±0.01 0.21±0.02 0.15±0.02模型組 6 - 1.50±0.06a 1.50±0.06a 0.96±0.07a木犀草素低劑量組6 50 1.45±0.06a 1.48±0.05a 0.96±0.05a木犀草素高劑量組6 200 0.40±0.05ab 0.80±0.05ab 0.30±0.03ab

3 討 論

慢性腎衰竭病位主要在腎，且與脾緊密相關(guān)，最終可累及五臟六腑。中醫(yī)學(xué)中慢性腎衰竭的發(fā)病因素包括腎氣不足和感染風(fēng)寒暑濕燥火六淫?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為慢性腎衰竭的病理表現(xiàn)主要為腎臟纖維化，包括腎小球硬化、腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化等[11-12]。目前慢性腎衰竭的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，其中炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致腎臟組織損傷并促進(jìn)腎衰竭的進(jìn)展已被證實(shí)[13]。研究發(fā)現(xiàn)[14]核轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路能夠調(diào)控核內(nèi)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄或者表達(dá)，對(duì)炎癥介質(zhì)的生成具有顯著影響，能促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生，從而使得腎臟組織持續(xù)處于微炎癥狀態(tài)，導(dǎo)致腎臟組織纖維化，加劇腎臟損傷，促進(jìn)腎衰竭的進(jìn)展。

本研究發(fā)現(xiàn)模型組和木犀草素低劑量組大鼠均出現(xiàn)消瘦、脫毛、毛發(fā)粗糙無(wú)光，不思飲食，尿量較少，大便較稀，而木犀草素高劑量組和對(duì)照組大鼠狀態(tài)基本一致，只有動(dòng)作略微遲緩、毛發(fā)暗淡現(xiàn)象，提示高劑量（200 mg/kg）木犀草素能夠明顯改善慢性腎衰竭大鼠行為狀態(tài)，降低死亡率。有研究表明，慢性腎衰竭導(dǎo)致腎臟功能受損，腎臟清除率降低，代謝產(chǎn)物、炎癥因子等不能有效排出體外，導(dǎo)致血液中代謝產(chǎn)物、炎癥因子等含量升高[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中BUN和Scr含量明顯升高，表明腎臟排泄代謝產(chǎn)物的能力降低，腎臟功能惡化[16]；而且模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量明顯升高，病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腎臟組織體積增大，蒼白無(wú)血色，大量炎性浸潤(rùn)，間質(zhì)纖維化，腎小囊腔擴(kuò)張嚴(yán)重，表明機(jī)體炎癥水平高，腎臟處于炎癥狀態(tài)，進(jìn)一步加重了腎臟纖維化及腎臟損傷[17]。與模型組比較，木犀草素高劑量組大鼠血清中BUN、Scr、IL-6、TNF-α含量明顯下降，木犀草素低劑量組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)木犀草素高劑量組大鼠腎臟組織炎性浸潤(rùn)較少，腎小囊腔呈現(xiàn)輕度擴(kuò)張，間質(zhì)纖維化程度較輕，腎臟組織有血色，而木犀草素低劑量組與模型組病理情況基本一致，故200 mg/kg的木犀草素具有抗炎作用，可以提高代謝產(chǎn)物的清除功能，同時(shí)促進(jìn)代謝產(chǎn)物排泄等，進(jìn)一步減少炎癥因子在機(jī)體內(nèi)的堆積，表明200 mg/kg的木犀草素可以明顯改善慢性腎衰竭大鼠腎功能損傷，減輕炎癥反應(yīng)。

當(dāng)腎小管受到氧化損傷以后，機(jī)體氧化應(yīng)激機(jī)制啟動(dòng)，活性氧的活性得到加強(qiáng)，導(dǎo)致TLR4/NF-κB信號(hào)通路發(fā)生活化，促進(jìn)炎癥因子產(chǎn)生，加深氧化應(yīng)激對(duì)腎臟的損傷，而且TLR4/NF-κB信號(hào)通路會(huì)促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變成間充質(zhì)，由此使得腎小管上皮細(xì)胞失去正常功能，而具備了間充質(zhì)的功能，導(dǎo)致腎臟發(fā)生纖維化，隨著病情進(jìn)展，逐漸導(dǎo)致腎功能消失，出現(xiàn)腎衰竭，所以抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路對(duì)于減緩慢性腎衰竭的發(fā)生具有重要的意義[18]。TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活和p-p65、p-IκB有關(guān)，因此可以通過(guò)檢測(cè)p-p65、p-IκB水平發(fā)現(xiàn)激活該信號(hào)通路的途徑[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎臟組織TLR4、p-p65、p-IκB蛋白表達(dá)水平明顯著升高，TLR4/NF-κB信號(hào)通路被激活；與模型組比較，木犀草素高劑量組大鼠腎臟組織中TLR4、p-p65、p-IκB蛋白表達(dá)水平明顯下降，而木犀草素低劑量組與模型組比較無(wú)明顯變化。因此，200 mg/kg的木犀草素可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，改善慢性腎衰竭大鼠腎臟功能損傷。

綜上所述，200 mg/kg的木犀草素能夠改善慢性腎衰竭大鼠腎功能損傷，減輕炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能是抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路。