馬啟明，梁小敏，曾廣豐

（1.廣州檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)有限公司，國(guó)家加工食品質(zhì)量檢驗(yàn)中心（廣東），廣州 511447；2.廣州海關(guān)技術(shù)中心，廣州 510623）

0 引言

香蘭素（Vanillin）及其同系物是一類(lèi)重要的食品添加劑，具體奶香的氣味。因?yàn)榫哂袕?qiáng)烈的奶香味，可增加食欲[1]。有研究指出，香蘭素對(duì)奶牛的生產(chǎn)性能及血清生化指標(biāo)無(wú)顯著影響[2]，但大量的攝入香蘭素對(duì)肝臟和腎臟的功能造成損害[3]。《GB 2760-2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中也規(guī)定較大嬰兒和幼兒配方食品中香蘭素和乙基香蘭素的最大使用量為5 mg/100 mL[4]，0～6 個(gè)月的嬰幼兒食品更是不得添加。但為了令產(chǎn)品更加吸引嬰兒或其他消費(fèi)者，質(zhì)量安全問(wèn)題存在著較大的隱患。

目前，香蘭素的檢測(cè)方法主要集中在氣相色譜法[5]、氣相色譜-質(zhì)譜法[6-9]、液相色譜法[10-11]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-14]，本文建立的超高效液相色譜-四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜法（Ultra performance liquid chro?matography-quadrupole time of flight mass spectrome?ter，UPLC-Q-TOF/MS），對(duì)目標(biāo)物的分子量進(jìn)行精確測(cè)定，相對(duì)于串聯(lián)質(zhì)譜法有更強(qiáng)的定性能力。方法的回收率，精密度和檢出限都能達(dá)到日常分析測(cè)定的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奶粉，廣州市售；無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸氫二鈉和檸檬酸鈉（分析純），廣州試劑廠(chǎng)；乙腈（色譜純），美國(guó)Fisher 公司；甲酸（色譜純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；石墨化炭黑（GCB）、十八烷基鍵合硅膠（C18）、N-丙基乙二胺（PSA）、增強(qiáng)型基質(zhì)去除固相吸附劑（EMR），美國(guó)安捷倫公司；香蘭素、香豆素、甲基香蘭素、乙基香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.8%），德國(guó)Dr.EhrenstorferGmbH 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple TOF?5600+高分辨質(zhì)譜儀，美國(guó)ABsciex公司；UPLC 20AD 高效液相色譜儀，日本島津公司；電子天平；4k-15 離心機(jī)，北京卓明貿(mào)易有限公司；IKA Vortex4 渦旋混勻器，廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；Milli-Q 去離子水發(fā)生器，美國(guó)Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取適量香蘭素、香豆素、甲基香蘭素、乙基香蘭素的標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為500 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

中間液：用乙腈將儲(chǔ)備液稀釋至20 mg/L，得到標(biāo)準(zhǔn)中間液，，于-4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

工作曲線(xiàn)（基質(zhì)曲線(xiàn)使用空白基質(zhì)液配制）：吸取上述中間液用乙腈稀釋成工作曲線(xiàn)，各單點(diǎn)質(zhì)量濃度分別為2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100，200 mg/L。

1.3.2 樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取奶粉樣品2 g 于50 mL 離心管中，加入15 mL 水，充分溶解以后加入10 mL 乙腈。充分混勻后加入4 g 無(wú)水硫酸鎂、1 g 氯化鈉、0.5 g 檸檬酸氫二鈉和1 g 檸檬酸鈉，搖床提取20 min，10 000 r/min 離心5 min。稱(chēng)EMR 凈化劑1 g 于15 mL 離心管中，先用2 mL 水活化5 min，然后轉(zhuǎn)移上清液到此離心管中，渦旋混合10 min，4 000 r/min 離心5 min。取3 mL上清液用1 g 無(wú)水硫酸鎂吸水后，過(guò)0.22 μm 有機(jī)膜待上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Atlantis T3 C18（150 mm× 2.1 mm，3.0 μm）；柱溫為40 ℃；樣品室溫度20 ℃；進(jìn)樣量為5 μL；流動(dòng)相A 為乙腈，B 為體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸水溶液，采用梯度洗脫方式洗脫分離：0～10 min 5%～50% A，10～12 min 50%～80% A，12～13 min 80%～5% A，13～15 min 5% A；流速為0.35 mL/min。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源：ESI 和APCI 復(fù)合源；掃描方式：正離子掃描；APCI 源連接ABsciex 公司自動(dòng)校正系統(tǒng)（CDS），每5 個(gè)樣品進(jìn)行1 次自動(dòng)校正，正離子模式校正液流速為0.5 mL/min，氣簾氣：276 kPa，離子源霧化氣：345 kPa，離子源加熱輔助氣：345 kPa，離子源溫度：500 ℃，離子源電壓5 500V。一級(jí)（TOF）掃描質(zhì)量范圍（m/z）：50～1 000 u；二級(jí)IDA-MS 掃描準(zhǔn)確質(zhì)量范圍：50～1 000 u，DP：60V，CE：（25±10）V；高靈敏模式，數(shù)據(jù)采集時(shí)間50 ms，信號(hào)閾值100（每秒采集的電子數(shù)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 待測(cè)化合物的質(zhì)譜分析依據(jù)

根據(jù)TOF-MS 和IDA-MS 高分辨質(zhì)譜獲得化合物的數(shù)據(jù)，定性定量分析奶粉中的香豆素和3 種香蘭素。采用LC-Q-TOF-MS液相色譜高分辨質(zhì)譜方法檢測(cè)分析奶粉中的香豆素和3 種香蘭素，根據(jù)所采集的化合物保留時(shí)間、一級(jí)母離子精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比和二級(jí)碎片離子等信息進(jìn)行定性定量；4 種目標(biāo)化合物的具體質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。目標(biāo)化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)在使用Analyst TF 1.6 軟件采集，數(shù)據(jù)在PeakView 2.0，MasterView 2.0 和MultiQuant 3.0 等軟件上處理分析。

表1 4種化合物的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)

2.2 待測(cè)化合物質(zhì)譜碎裂途徑分析

通過(guò)4 種化合物的二級(jí)碎片（見(jiàn)表2），可得知，在正模式+H 條件下，香蘭素和乙基香蘭素均具有m/z 93 的碎片，而其他化合物的碎片均沒(méi)有重復(fù)。對(duì)4 種化合物的質(zhì)譜碎裂途徑進(jìn)行分析，香蘭素的主要碎片為[C7H9O2]+m/z 125 和[C6H5O]+m/z 93，碎片m/z 125 為香蘭素丟失醛基形成，碎片m/z 93 為香蘭素丟失醛基和甲氧基形成。甲基香蘭素的主要碎片為[C8H11O2]+m/z 139 和[C7H9O]+m/z 124，碎片m/z 139為甲基香蘭素丟失醛基形成，碎片m/z 124 為甲基香蘭素丟失醛基和其中一個(gè)甲氧基形成。乙基香蘭素的主要碎片為[C6H7O2]+m/z 111 和[C6H5O]+m/z 93，碎片m/z 111 為乙基香蘭素丟失醛基和乙氧基丟失乙基后形成，碎片m/z 93 為乙基香蘭素丟失醛基和乙氧基形成。香豆素的主要碎片為[C8H7]+m/z 103 和[C6H3O]+m/z 91，基峰為m/z 103，由苯并環(huán)上的碳氧鍵斷裂和羰基位碳碳鍵斷裂后形成。詳細(xì)碎裂途徑可見(jiàn)圖1。

表2 4種化合物的二級(jí)質(zhì)譜碎片

圖1 4種化合物的質(zhì)譜碎裂途徑

2.3 方法條件的優(yōu)化

2.3.1 流動(dòng)相的選擇和梯度的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)前期分別對(duì)香蘭素、香豆素、甲基香蘭素、乙基香蘭素的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行正負(fù)離模式掃描，由于4 種化合物結(jié)構(gòu)上含有O 原子，親核性更強(qiáng)，所以正離子模式下，響應(yīng)值均高于負(fù)模式。而在正模式下，流動(dòng)相中加入甲酸，可為體系提供質(zhì)子，使目標(biāo)物形成更加穩(wěn)定的準(zhǔn)分子離子峰，響應(yīng)更高。由于甲基香蘭素和乙基香蘭素是同分異構(gòu)體，即使質(zhì)譜也不能分別準(zhǔn)確定量，因此需要調(diào)整色譜梯度，使其分離。在調(diào)整過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，甲醇雖然和乙腈相比，洗脫能力較弱，但結(jié)果對(duì)比，保留時(shí)間變化并不明顯，而使用乙腈為流動(dòng)相，4 種化合物的峰型更加對(duì)稱(chēng)，因此選擇乙腈作為流動(dòng)相的有機(jī)相，通過(guò)調(diào)整洗脫梯度，4 種化合物在8 min 內(nèi)達(dá)到良好分離。4 種化合物的提取離子流色譜圖如圖2。

圖2 4種化合物的提取離子流色譜

2.3.2 固相萃取劑種類(lèi)的選擇

為了避免樣品在測(cè)定過(guò)程中產(chǎn)生較大的基質(zhì)效應(yīng)，所以要對(duì)提取液進(jìn)行凈化，同時(shí)要避免固相萃取劑對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行吸附。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了PSA、GCB、C18和EMR 4 種固相萃取劑對(duì)香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素回收率的影響。結(jié)果表明，GCB 對(duì)4 種化合物吸附程度較高，而香蘭素和乙基香蘭素均具有酚羥基，同時(shí)含有O 原子，可能較易與PSA 中的胺基形成吸附作用力，因此回收率也較低。而C18 和EMR 除了能吸附提取液中的脂溶性雜質(zhì)外，對(duì)目標(biāo)物的吸附也較少，回收率較高，但EMR 的回收率要高于C18，因此，最終選擇EMR 為凈化用固相萃取劑，如圖3所示。

圖3 不同固相萃取劑對(duì)回收率的影響

2.3.3 EMR 用量的優(yōu)化

初步確定使用EMR 為凈化用固相萃取劑后，對(duì)EMR 的用量進(jìn)行優(yōu)化。由于奶粉中含有較多的油脂，使用EMR 凈化能有較好的效果，在確保目標(biāo)物回收率的情況下，EMR 用量越大，對(duì)基質(zhì)效應(yīng)消除的效果就越好。在凈化提取液體積為10 mL 的情況下，使用了不同量的EMR 進(jìn)行凈化，結(jié)果表明，當(dāng)EMR 用量為1 000 mg 的時(shí)候，4 種目標(biāo)物的回收率較高，而用量繼續(xù)增加，回收率上升不明顯，因此，最終選擇EMR 用量為1 000 mg。結(jié)果如圖4所示。

圖4 EMR用量對(duì)回收率的影響

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的探究

由于奶粉中油脂較多，在測(cè)定的過(guò)程中，有可能會(huì)影響目標(biāo)物的離子化程度，從而影響響應(yīng)值。這種情況下若以純?nèi)軇┣€(xiàn)定量，會(huì)導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)較大的偏差。因此，在儀器分析的過(guò)程中，若存在基質(zhì)效應(yīng)，則需要用基質(zhì)曲線(xiàn)對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行校正。實(shí)驗(yàn)使用4種目標(biāo)物呈陰性的奶粉，按樣品處理方法1.3.2 進(jìn)行處理，得到空白基質(zhì)液后配制基質(zhì)曲線(xiàn)。將基質(zhì)曲線(xiàn)的斜率和純?nèi)軇┣€(xiàn)的斜率之比定義為基質(zhì)效應(yīng)（Ma?trix effect，ME），當(dāng)ME 值在80%～120%之間時(shí)，則認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)不明顯，反之，則需要用基質(zhì)曲線(xiàn)進(jìn)行定量。而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4 種化合物的ME 值在55.8%～62.7%之間，因此，最終采用基質(zhì)曲線(xiàn)進(jìn)行定量。

2.5 線(xiàn)性關(guān)系和方法檢出限、定量限

使用空白基質(zhì)液稀釋標(biāo)準(zhǔn)工作液，得到一系列質(zhì)量濃度不同的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化后的色譜及質(zhì)譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積Y 為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X（μg/L）為橫坐標(biāo)進(jìn)行繪圖。對(duì)樣品進(jìn)行低濃度加標(biāo)，分別按3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）計(jì)算檢出限（LOD）和定量限（LOQ），4 種化合物的檢出限為10.0～20.0 μg/kg，定量限為35.0～60.0 μg/kg，說(shuō)明方法的靈敏度較高，可用于測(cè)定實(shí)際樣品，見(jiàn)表3。

表3 4種化合物的定量參數(shù)

2.6 回收率與精密度實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)選擇市售的奶粉按照前處理方法進(jìn)行測(cè)定，選取陰性樣品，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。為了方便實(shí)驗(yàn)，以檢出限較高的香蘭素和香豆素為基準(zhǔn)，選擇其檢出限的1倍、5倍和10倍水平進(jìn)行添加。每個(gè)水平分別測(cè)定6次，并計(jì)算得出相對(duì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果測(cè)得，香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的平均回收率在77.0%～94.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.76%～4.77%，詳見(jiàn)表4。表明方法回收率高，重現(xiàn)性好，能有效測(cè)定奶粉中的香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素。

表4 奶粉中4種化合物的加標(biāo)回收率（n=6）

2.7 方法的實(shí)際測(cè)定

為進(jìn)一步考察所建立的方法是否能有效應(yīng)用于實(shí)際樣品的測(cè)定，隨機(jī)選擇了市售的檢30 個(gè)奶粉樣品，1 段15 個(gè)，2 段10 個(gè)，3 段5 個(gè)進(jìn)行測(cè)定。30 個(gè)樣品中香豆素和甲基香蘭素均未檢出，其中2 個(gè)1 段奶粉檢出乙基香蘭素（34.1 μg/kg 和133 μg/kg）和香蘭素（66.2 μg/kg 和102 μg/kg），1 個(gè)3 段奶粉檢出乙基香蘭素（88.6 mg/kg）。分析認(rèn)為應(yīng)該是生產(chǎn)線(xiàn)污染帶來(lái)，但對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量安全仍存在較大的風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)論

采用乙腈對(duì)奶粉中的香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素進(jìn)行提取，提取過(guò)程高效簡(jiǎn)單；用EMR 對(duì)提取液進(jìn)行凈化，有效去除提取液中的油脂，降低了基質(zhì)效應(yīng)；結(jié)合超高效液相色譜，所有化合物在8 min 內(nèi)出峰，且峰型良好，同時(shí)互為同分異構(gòu)體的甲基香蘭素、乙基香蘭素也有較好的分離；使用高分辨質(zhì)譜準(zhǔn)確測(cè)定了目標(biāo)物的精確分子量，提升了方法的整體定性能力，大大降低了假陽(yáng)性的可能；用基質(zhì)曲線(xiàn)進(jìn)行定量，校正了基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)方法學(xué)數(shù)據(jù)表明，該方法回收率高，且選擇性和靈敏度高，適用于奶粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素含量的分析檢測(cè)，為乳制品的相關(guān)質(zhì)量安全檢測(cè)研究提供了參考依據(jù)。