肖正中，凌文卿，蔡秋香，陳少珍，周文杰，鄔蘇曉

（韶關(guān)學(xué)院 英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

糞腸球菌也稱糞鏈球菌，廣泛存在于人和動(dòng)物腸道中，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中常作為益生菌使用［1］，同時(shí)也是一種重要的條件致病菌，能夠引起人和動(dòng)物多個(gè)器官的感染［2-3］.近年來(lái)關(guān)于糞腸球菌感染的報(bào)道也越來(lái)越多［4-5］.由于抗生素的廣泛使用，許多糞腸球菌逐漸發(fā)展成為獲得耐藥性菌株，其所致感染較難控制，使得臨床藥物治療的難度越來(lái)越大，一些經(jīng)驗(yàn)性的藥物治療很難充分發(fā)揮作用［6-8］，由此造成養(yǎng)豬生產(chǎn)中病死率增加的風(fēng)險(xiǎn)也逐步提高.本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)豬源糞腸球菌的分離鑒定及分離株的藥物敏感性分析，為豬場(chǎng)臨床合理用藥提供參考，為動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)提供數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

豬直腸糞樣31 份，采集于粵北某豬場(chǎng).

1.1.2 藥品與試劑

PSE 培養(yǎng)基、M-H 培養(yǎng)基、疊氮化鈉葡萄糖肉湯培養(yǎng)基均購(gòu)自青島海博生物公司；PCR 相關(guān)試劑（Premix TaqTM、DNA DL2000 Maker、緩沖液等）購(gòu)自TaKaRa 公司；藥敏試紙購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司.

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

以無(wú)菌棉拭子于豬肛門(mén)處采樣，接種于疊氮化鈉葡萄糖肉湯培養(yǎng)基，于37 ℃增菌培養(yǎng)12 h.

1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

取增殖培養(yǎng)的菌液接種于PSE 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取黑色單菌落，接種于疊氮化鈉葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行初次擴(kuò)純培養(yǎng).將擴(kuò)純培養(yǎng)的菌液劃線接種于PSE 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取黑色單菌落，再次進(jìn)行純化培養(yǎng).

1.2.3 革蘭氏染色

取純化培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，于顯微鏡油鏡下觀察其染色特性及形態(tài)和排列.

1.2.4 PCR 鑒定

1.2.4.1 引物

糞腸球菌特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因Ef0027，由TaKaRa 公司合成，預(yù)擴(kuò)增片段518 bp［9］.

P1：5′-GCCACTATTTCTCGGACAGC-3′；P2：5′-GTCGTCCCTTTGGCAAATAA-3′.

1.2.4.2 PCR 鑒定條件

采用煮沸法提取細(xì)菌基因組DNA，取上清作為DNA 模板.PCR 反應(yīng)體系為25 μL：其中模板DNA 2 μL， PCR Taq Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，加dd H2O 補(bǔ)至25 μL. PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 次循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min.反應(yīng)完成后取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，于濃度為1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)PCR 擴(kuò)增結(jié)果.

1.2.5 藥敏試驗(yàn)

選取取青霉素、諾氟沙星、頭孢曲松鈉等38 種抗生素，采用K-B 法對(duì)糞腸球菌分離株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn).參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）2018 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)糞腸球菌耐藥性進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

31 份豬直腸糞樣于疊氮化鈉葡萄糖培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h 后，培養(yǎng)基呈均勻渾濁，將樣品培養(yǎng)菌液接種于PSE 瓊脂培養(yǎng)基，其中15 份樣品在PSE 瓊脂培養(yǎng)基上有棕黑色、圓形、邊緣光滑、表面濕潤(rùn)、不透明疑似糞腸球菌菌落生成，挑取黑色疑似候選菌落進(jìn)一步擴(kuò)純培養(yǎng).

2.2 細(xì)菌革蘭氏染色

將分離擴(kuò)純培養(yǎng)獲得的15 個(gè)疑似候選菌進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果呈陽(yáng)性.在顯微鏡油鏡下觀察，菌體呈球形，以短鏈狀排列，無(wú)芽孢和莢膜，見(jiàn)圖1.

圖1 分離菌革蘭氏染色結(jié)果

2.3 PCR 鑒定

對(duì)15 個(gè)疑似候選菌落Ef0027 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分別獲得3 條約518 bp的電泳條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，見(jiàn)圖2.

圖2 分離菌株Ef0027 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn)

將PCR 鑒定陽(yáng)性菌分別進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1.根據(jù)CLSI（2018）判定標(biāo)準(zhǔn)，3 株糞腸球菌對(duì)11類38 種藥物總耐藥率為69.3%，對(duì)頭孢克肟、羧芐西林、鏈霉素、林可霉素、四環(huán)素等17 種藥物均耐藥，占總藥物數(shù)的44.7%，其中分離菌株對(duì)磺胺類、林可胺類、苯丙醇類、四環(huán)素類、甲硝唑等藥物呈100%耐藥，對(duì)其它藥物的耐藥率分別為：頭孢類83.3%，大環(huán)內(nèi)酯類77.8%，呋喃唑酮66.7%，青霉素類44.4%，氟喹諾酮類和氨基糖苷類41.7%，糖肽類33.3%.結(jié)果表明，由該豬場(chǎng)分離的糞腸球菌存在普遍耐藥情況，且多重耐藥和交叉耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重.

表1 糞腸球菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

近年來(lái)，動(dòng)物源糞腸球菌感染日益增多，臨床上耐藥菌株不斷出現(xiàn)，多重耐藥現(xiàn)象普遍，相關(guān)報(bào)道屢見(jiàn)不鮮，對(duì)動(dòng)物性食品衛(wèi)生安全及人類公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了極大威脅［10-12］.此外，由于糞腸球菌還編碼眾多毒力基因，又增加了對(duì)該病臨床防治的困難［13］.本實(shí)驗(yàn)從31 份豬直腸糞樣中分離到3 株糞腸球菌，分離率為9.8%，分離株總耐藥率為69.3%，耐藥率70%以上的抗菌素有磺胺類、林可胺類、苯丙醇類、四環(huán)素類、甲硝唑、頭孢類和大環(huán)內(nèi)酯類，耐藥率40%左右的有青霉素類、氟喹諾酮類、糖肽類、氨基糖苷類及呋喃唑酮，分別占11 大類藥物的64.5%和45.5%，結(jié)果說(shuō)明該豬源糞腸球菌對(duì)大多數(shù)抗菌藥呈高度耐藥，且多重耐藥和交叉耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，從而在一定程度上增加了豬場(chǎng)抗感染治療的難度.

糞腸球菌作為革蘭氏陽(yáng)性菌耐藥的指示菌，其耐藥機(jī)制復(fù)雜，存在對(duì)某些抗菌藥物的固有耐藥性及獲得性耐藥，尤其是耐萬(wàn)古霉素腸球菌（VRE）的快速增加使得VRE 成為臨床感染的重要病原菌［14-15］.萬(wàn)古霉素常用于耐藥革蘭氏陽(yáng)性菌的治療，隨著糖肽類藥物的大量使用，耐萬(wàn)古霉素細(xì)菌出現(xiàn)并有增多趨勢(shì)，VRE 成為臨床重點(diǎn)關(guān)注的病原菌，其對(duì)細(xì)菌耐藥性檢測(cè)具有重要意義.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，此次豬糞腸球菌分離株對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥率為33.3%，說(shuō)明該豬場(chǎng)細(xì)菌耐藥性問(wèn)題異常嚴(yán)重，已經(jīng)出現(xiàn)了耐萬(wàn)古霉素的糞腸球菌，應(yīng)該引起豬場(chǎng)獸醫(yī)的重視.

細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生可能和臨床長(zhǎng)期用藥習(xí)慣、用藥頻率及用藥方式等因素有關(guān).因此，臨床用藥應(yīng)參考藥敏試驗(yàn)結(jié)果制定合理的給藥方案，合理選藥，正確用藥，持續(xù)進(jìn)行耐藥性監(jiān)測(cè)并及時(shí)預(yù)警，及時(shí)調(diào)整，以延緩耐藥菌株出現(xiàn)，降低細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生機(jī)率.

細(xì)菌耐藥性可通過(guò)耐藥基因在人和動(dòng)物之間相互傳遞，糞腸球菌作為革蘭氏陽(yáng)性菌耐藥的指示菌，對(duì)動(dòng)物源糞腸球菌的耐藥性分析和研究具有重要意義［16-17］，因此進(jìn)一步研究其耐藥表型和耐藥基因型之間的關(guān)系對(duì)研究糞腸球菌耐藥機(jī)制和臨床防治具有重要意義.