林 童，郭徐靜，武敬宇，熊勇華，郭 亮

(南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047)

基于納米材料的免疫檢測探針因優(yōu)異的信號輸出能力在分析測試領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用[1-3]。充分暴露納米材料表面抗體的抗原結(jié)合區(qū)Fab片段有利于免疫探針捕獲抗原，提高免疫檢測性能。目前，在納米粒子表面固定抗體的方法有物理吸附法、共價偶聯(lián)法和生物親和法等。其中，物理吸附法[4-5]相對簡單。但是使用該方法制備的抗體-納米顆粒復(fù)合物不穩(wěn)定，重復(fù)性差，且抗體在納米粒子表面無法定向。生物親和法是通過親和素-生物素系統(tǒng)或抗體結(jié)合蛋白介導(dǎo)的偶聯(lián)方式。其偶聯(lián)產(chǎn)物的穩(wěn)定性雖優(yōu)于物理吸附，但所用蛋白價格昂貴。共價偶聯(lián)法可形成穩(wěn)定的抗體-納米顆粒復(fù)合物，有效避免抗體在檢測及儲存過程中脫落，且無需使用額外的結(jié)合蛋白。利用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)活化羧基使納米粒子與抗體間通過酰胺鍵連接是最為常用的共價偶聯(lián)方法[6-7]。然而由于抗體中廣泛分布氨基和羧基，使抗體與納米材料的結(jié)合不是位點特異性的，導(dǎo)致抗體在納米粒子表面仍是隨機取向。由于無法充分暴露Fab片段，該方法制備的復(fù)合物表面的有效抗體數(shù)不足4%[8]。同時，通過酰胺鍵連接抗體還可能導(dǎo)致抗體自交聯(lián)，由此形成的多層抗體可產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，使抗體的抗原結(jié)合能力進一步降低。IgG是一種糖基化蛋白，其恒定區(qū)Fc片段具有寡糖鏈。因此通過氧化Fc片段上的碳水化合物可獲得醛基[9]，從而可與氨基修飾的納米粒子實現(xiàn)位點特異性的共價偶聯(lián)。然而，其氧化反應(yīng)及醛基氨基偶聯(lián)步驟易破壞抗體天然構(gòu)象，降低抗體活性。另一種相對簡單的位點特異性抗體偶聯(lián)策略是在納米粒子表面修飾可特異性結(jié)合Fc片段的蛋白[10]，如蛋白A、蛋白G和Fc受體。但是這種結(jié)合是非共價偶聯(lián)，且此類結(jié)合蛋白價格昂貴，使檢測成本增加。

硼酸在適當(dāng)?shù)膒H條件下可以與含順式二醇的分子，如糖類和糖蛋白等，快速形成穩(wěn)定的環(huán)狀酯。因此，表面修飾硼酸基團的各類材料最初被廣泛應(yīng)用于捕獲糖蛋白及構(gòu)建糖蛋白傳感器[11]。此后，Lin等[12]制備硼酸功能化磁珠并利用抗體Fc片段上的寡糖和硼酸間的親和作用在其表面定向結(jié)合抗體，用于捕獲富集相應(yīng)抗原。與表面抗體非定向偶聯(lián)的磁珠相比，其提取效率可提高5倍。該研究使硼酸化納米材料的應(yīng)用拓展至不含糖的靶標(biāo)的捕獲，如藥物[13]、毒素[14]等。近年來，硼酸介導(dǎo)的抗體固定化在相應(yīng)抗原的免疫法檢測中也開始有所應(yīng)用。例如，Zeininger等人[15]在硼酸化的直徑為100 μm的熒光液滴表面偶聯(lián)腸道沙門氏菌抗體，利用抗體與沙門氏菌結(jié)合后液滴熒光的變化進行檢測。Wang等人[16]則在硼酸化的熒光氮化碳納米片表面偶聯(lián)抗體，利用抗體與抗原結(jié)合后氮化碳納米片熒光的變化檢測多種生物標(biāo)志物。本研究在合成硼酸修飾的聚馬來酸酐-alt-1-十八碳烯(PBA-PMAO)的基礎(chǔ)上，采用超聲乳化法制備表面硼酸改性的量子點熒光微球(PBA-QBs)，并將其與甲胎蛋白(AFP)單克隆抗體結(jié)合制備高抗體活性的熒光檢測探針用于定量免疫層析檢測AFP。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

CdSe/ZnS量子點，美國Ocean NanoTech公司；十二烷基磺酸鈉(SDS)、聚馬來酸酐-alt-1-十八烯(PMAO,MW=30000-50000)，美國Sigma公司； 3-氨基苯硼酸 (3-APBA)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，上海Aladdin公司；山羊抗IgG抗體，重慶欣源佳和生物科技有限公司；AFP標(biāo)準(zhǔn)品、一對抗AFP單克隆抗體(標(biāo)記與包被)，上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司。硝酸纖維素膜(NC膜)、吸水紙、PVC粘性底板，上海捷寧生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)品均為分析級。AFP陰性人血清樣品由江西省第一人民醫(yī)院醫(yī)院提供。

UNICELL干式熒光免疫分析儀，亞輝龍生物科技股份有限公司；F-4500熒光分光光度計，日立公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；可編程切條機、HGS510劃膜噴金機，杭州峰航科學(xué)儀器有限公司；TGL-16型高速冷凍離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；粒度與Zeta電位分析儀，馬爾文公司；超純水儀，Millipore公司；JEOL JEM 2100型透射電鏡，JEOL公司；分析天平，梅特勒-托利公司；ZF-2型三用紫外儀，上海市安亭電子儀器廠。

1.2 PBA-PMAO的合成

用15 mL三氯甲烷充分溶解350.0 mg PMAO、136.9 mg 3-APBA和122.0 mg DMAP后，將溶液轉(zhuǎn)至圓底燒瓶并置于50 ℃油浴中勻速攪拌反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液快速冷卻至室溫，向其中加入60 mL pH=5.0的硫酸氫鉀水溶液，充分振蕩，4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min。離心結(jié)束后，去除上層水相，用移液槍吸取下層油相轉(zhuǎn)移至新離心管中，重復(fù)洗滌3次。隨后將油相置于含15 mL超純水的圓底燒瓶中，25 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至不再析出白色固體。旋蒸產(chǎn)物經(jīng)減壓過濾后，將白色固體轉(zhuǎn)至潔凈、干燥的玻璃培養(yǎng)皿中，置于60℃烘箱中干燥12 h，即可得到PBA-PMAO。

1.3 PBA-QBs的合成

PBA-QBs的合成采用微乳液法[17]。將5 mg量子點和10 mg PBA-PMAO充分溶解于110 μL三氯甲烷中，再向其中加入250 μL一定濃度的SDS水溶液，充分振蕩混勻。混合液用細胞破碎儀超聲乳化后(超聲條件：超聲總時間2 min；運行時間10 s；暫停時間5 s；超聲功率 80 W)，將微乳液置于60 ℃水浴加熱4 h除去三氯甲烷。PBA-QBs懸液離心15 min后，將沉淀重懸于于1 mL堿水(pH=10)中，振蕩水解過夜。最后將懸液離心除去上清，用超純水重復(fù)洗滌PBA-QBs 2次后復(fù)溶至1 mL超純水中，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PBA-QB免疫探針的制備

將0.6 mg PBA-QBs、45 μg抗AFP單克隆抗體(標(biāo)記)及4 mL pH=7的 0.01 M PB緩沖液充分混勻，室溫攪拌反應(yīng)5 min。加入0.2 mg葡萄糖，封閉反應(yīng)3 min后以13 500 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心15 min，沉淀復(fù)溶于2 mL PB復(fù)溶液中(含0.01M pH 7.4 PB緩沖液，含0.1% NaN3(w/v))，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PBA-QBs熒光試紙條的制備及免疫層析檢測流程

PBA-QBs熒光試紙條的制備[18]過程如下：將1.5 mg·mL-1的抗AFP單克隆抗體(包被)、1.0 mg·mL-1羊抗鼠IgG抗體以6 mm 的距離噴分別涂于NC膜上做為檢測AFP的檢測線(T線)與質(zhì)控線(C線 )；隨后將NC膜置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中37 ℃干燥12 h；最后將制備好的NC膜、樣本墊、吸水紙依次黏貼于PVC 底板上，再使用可編程切條機將其切割為寬度3.9 mm的成品試紙條，室溫密封干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品中AFP的檢測流程如下：將2 μL PBA-QB免疫檢測探針與68 μL AFP樣本溶液充分混合孵育5 min后，加入到試紙條的樣品孔中，室溫層析20 min后用干式熒光免疫分析儀讀取其T線熒光強度(FIT)、C線熒光強度(FIC)。

免疫層析檢測原理如圖1所示：當(dāng)樣本溶液中含有AFP時，PBA-QB免疫探針與AFP結(jié)合形成的免疫復(fù)合物，隨溶液在NC膜中向前涌動至試紙條T線，并與固定在T線上的抗AFP單克隆抗體(包被)結(jié)合形成雙抗夾心免疫復(fù)合物，使T線區(qū)域顯現(xiàn)熒光；而當(dāng)樣本溶液中不含AFP時，PBA-QB免疫檢測探針不會被T線上的抗AFP單克隆抗體(包被)捕獲，無法形成夾心免疫復(fù)合物，T線區(qū)域無熒光；無論樣本溶液中是否含有AFP，未被T線捕獲的PBA-QB免疫檢測探針均會繼續(xù)向前遷移至C線區(qū)域，并被C線上的羊抗鼠IgG抗體捕獲產(chǎn)生熒光。若C線無熒光條帶產(chǎn)生，則說明該檢測結(jié)果無效。

圖1 PBA-QBs熒光免疫層析試紙條檢測AFP的原理圖

1.5 PBA-QBs熒光試紙條標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過倍比稀釋法將AFP標(biāo)準(zhǔn)品從250 ng mL-1稀釋至0.98 ng mL-1，用PBA-QBs熒光試紙條檢測各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個濃度重復(fù)檢測3次，在最佳讀取時間記錄FIT與FIC。以AFP濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)IT/FIC值為縱坐標(biāo)，繪制檢測AFP的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將20個陰性樣本(AFP濃度為：0 ng·mL-1)的FIT/FIC值的平均值加上其3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)帶入標(biāo)準(zhǔn)方程中，以計算出的AFP濃度作為最低檢測限。

1.6 PBA-QBs熒光試紙條性能評價

將經(jīng)化學(xué)發(fā)光法測定為AFP陰性的血清樣品用PBS緩沖液(pH=7.4)稀釋10倍。取3份上述血清稀釋液，向其中添加不同量的AFP標(biāo)準(zhǔn)品制備濃度分別為10，4和1 ng mL-1的加標(biāo)血清樣品。在一天內(nèi)，使用同一批次試紙條檢測以上加標(biāo)樣品，每個濃度重復(fù)檢測5次，計算回收率與變異系數(shù)，評價檢測的準(zhǔn)確度和批內(nèi)穩(wěn)定性；按上述方法重復(fù)檢測3天，計算回收率與變異系數(shù)，評價檢測的準(zhǔn)確度和批間穩(wěn)定性。將制備好的PBA-QBs熒光試紙條用鋁箔進行單個塑封，隔絕光線以及防止空氣濕度的變化，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保存。每隔7 d測定1次HBsAg陽性樣品(200 ng mL-1)，連續(xù)測定56 d，記錄試紙條的FIT/FIC值，以評價PBA-QBs熒光試紙條的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 PBA-PMAO的表征

PBA-PMAO合成的原理如圖2所示。PBA的氨基作為親核基團進攻PMAO中酸酐基團的羰基碳，形成酰胺鍵和游離的羧基。合成產(chǎn)物的傅里葉變換紅外光譜(FTIR)如圖3所示：2 925和2 853 cm-1峰是-CH2中的C-H伸縮振動峰；1 650 cm-1為酰胺(-CONH-)Ⅰ帶中C=O伸縮振動峰；1 552 cm-1峰為酰胺Ⅱ帶中C-N伸縮振動和N-H彎曲振動耦合形成的特征吸收峰；1 343，1 188和1 028 cm-1峰分別為硼酸基團(-B(OH)2)中的B-O伸縮振動峰、B-O-H彎曲振動峰和C-B伸縮振動峰[19]。由上可知，產(chǎn)物分子中含有酰胺鍵和苯硼酸基團，表明PBA-PMAO成功合成。

2.2 PBA-QBs的表征

通過調(diào)節(jié)SDS的濃度制備不同粒徑的PBA-QBs。如圖4a所示，當(dāng)SDS濃度為1，2，4和6 mg·mL-1時，PBA-QBs的水化粒徑分別為239.1，202.5，139.8和98.8 nm，多分散指數(shù)(PDI)分別為0.181，0.106，0.084和0.086。在同等質(zhì)量濃度下，以波長為365 nm的激發(fā)光激發(fā)，其熒光強度(發(fā)射波長：618 nm)分別為2 994，2 883，2 427和1 593(圖4b)。由于大粒徑的QBs粒徑分布相對不均一且可能產(chǎn)生相對較強的檢測背景信號[20]，而小粒徑QBs因熒光強度低不利于提高檢測靈敏度，因此本實驗選擇使用水化粒徑為202.5 nm的PBA-QBs制備免疫探針。其透射電鏡圖顯示(圖4c)，制備的PBA-QBs成規(guī)則的球形，且粒徑分布較均勻；單個粒子的高分辨率透射電鏡圖顯示，大量油溶性CdTe /ZnSe 量子點緊密的包埋于聚合物中。

圖2 PBA-PMAO的合成

λ/cm-1圖3 PBA-PMAO的紅外圖譜

Sizc/nm

λ/nm

圖4 使用不同濃度SDS溶液制備時PBA-QBs的水化粒徑(a)與熒光圖譜(b)； 使用2 mg mL-1SDS溶液制備的PBA-QBs的透射電鏡圖(c)

2.3 PBA-QB免疫探針的合成及表征

2.3.1 偶聯(lián)緩沖液pH的優(yōu)化

pH是決定硼酸與含順式二醇生物分子結(jié)合穩(wěn)定性的最重要因素。當(dāng)pH<硼酸pKa時，硼酸構(gòu)型趨向平面三角型(sp2雜化)，與順式二醇之間的結(jié)合有限；當(dāng)pH>硼酸pKa時，硼酸構(gòu)型趨向四面體型(sp3雜化)，可與順式二醇之間形成穩(wěn)定五元或六元環(huán)狀酯。由于傳統(tǒng)的硼酸材料pKa值相對較高(如氨基苯硼酸[21]，pKa=8.8)，其與IgG抗體結(jié)合通常需要一個偏堿性的pH值。而生物樣品的pH值一般在4.5～8.0之間，這會降低偶聯(lián)物在待測樣品中的穩(wěn)定性。本研究制備的PBA-PMAO(圖5a)是一種wulff型硼酸[22](O→B)，可降低PBA的pKa，使其硼酸基團在較低的pH下即可與抗體上糖基結(jié)合，從而避免偶聯(lián)過程中抗體失活及檢測時抗體脫落。

在不同pH的緩沖液中偶聯(lián)PBA-QB和AFP單抗制備免疫探針并將其用于AFP溶液檢測，優(yōu)化實驗均重復(fù)檢測3次并計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，依據(jù)FIT值的大小評價偶聯(lián)效率。從圖5b可知，隨著緩沖溶液pH值的升高，其FIT值逐漸增大；當(dāng)pH=7時，F(xiàn)IT達到最大值。其原因可能是pH=7時硼酸基團的構(gòu)型趨向四面體型，同時緩沖液pH值接近AFP單抗的等電點[23](IgG的pI= 6.95)，抗體帶電量較低，與硼酸間的靜電斥力較弱，利于抗體吸附在PBA-QBs表面并與硼酸結(jié)合。而當(dāng)pH值大于7時，F(xiàn)IT逐漸降低。其原因可能是溶液pH值大于抗體的等電點時，均帶負電的抗體與PBA-QBs發(fā)生靜電排斥，降低了抗體在微球表面的可及性，不利于與硼酸的共價結(jié)合。因此，選擇pH7做為最佳偶聯(lián)pH。

2.3.2 抗體添加量的優(yōu)化

使用不同量的AFP單抗在pH 7的緩沖液中偶聯(lián)PBA-QB制備免疫探針，并將其用于AFP溶液檢測，各實驗均重復(fù)3次并計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，依據(jù)FIT值的大小考察抗體最佳用量，結(jié)果如圖5c所示。當(dāng)AFP單抗添加量從15增加至 75 μg mg-1時，試紙條FIT逐漸上升；當(dāng)進一步增加抗體用量時，F(xiàn)IT反而降低。其原因可能是當(dāng)固定在QBs表面的抗體密度過高時，抗體間相互擠壓導(dǎo)致其天然構(gòu)象破壞或產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)。因此，選擇75 μg·mg-1作為最佳抗體添加濃度。

2.3.3 PBA-QB免疫探針表征

在最佳pH值和最佳抗體用量條件下制備免疫探針并表征其水化粒徑、Zeta電位及熒光圖譜。表征結(jié)果如圖6a與6b所示，抗AFP單克隆抗體(標(biāo)記)與PBA-QBs偶聯(lián)后，其平均水化粒徑從202.5增大至225.4 nm，Zeta電位從-47.9 mV上升為-39.7 mV,表明AFP單抗成功偶聯(lián)至PBA-QBs表面。由熒光發(fā)射光譜圖(圖6c)可知，偶聯(lián)抗體前后PBA-QBs的熒光峰型和熒光強度均基本一致，表明所制備的探針具有良好的熒光特性。

(a)PBA-PMAO中的wulff型硼酸

pH(b)偶聯(lián)緩沖液pH對FIT的影響

Amount of added AFP mAb/(μg mg-1) (c)抗體添加量對FIT的影響圖5 免疫探針制備條件優(yōu)化

λ/nm

Zeta Potcntial/mV

λ/nm圖6 PBA-QBs與抗體偶聯(lián)前后的水化粒徑(a)、Zeta電位(b)及熒光圖譜(c)

2.4 PBA-QBs熒光試紙條優(yōu)化

PBA-QBs熒光試紙條T線上AFP單克隆抗體(包被)噴涂濃度和探針用量是影響試紙條靈敏度的關(guān)鍵參數(shù)。在不同噴涂濃度和探針用量下檢測AFP溶液，各實驗均重復(fù)3次并計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，依據(jù)FIT值的大小進行優(yōu)化。從圖7a可知，當(dāng)T線上AFP單克隆抗體噴涂濃度從0.5 mg mL-1提高至1.5 mg mL-1時，F(xiàn)IT隨之升高；但當(dāng)濃度高于1.5 mg mL-1時，F(xiàn)IT基本無變化。圖7b表明，當(dāng)PBA-QB免疫探針的用量從0.5增加至2 μL時，F(xiàn)IT隨之升高；但當(dāng)用量大于2 μL時，F(xiàn)IT基本無變化。因此，本實驗試紙條制備時，T線AFP單克隆抗體(包被)濃度為1.5 mg mL-1，PBA-QBs探針用量為2 μL。

免疫層析時間是影響熒光試紙條定量分析的重要因素之一。因此需要通過建立FIT、FIC和FIT/FIC與免疫層析時間的反應(yīng)動力學(xué)曲線，確定最佳免疫層析時間。如圖7c所示，隨著免疫層析時間的延長，F(xiàn)IT、FIC及FIT/FIC值持續(xù)增大，且FIT、FIC值在30 min內(nèi)仍未達到穩(wěn)定值；而 FIT/FIC比值在層析20 min 后即趨于穩(wěn)定，并且在后 20 min內(nèi)比值無明顯變化。因此PBA-QBs熒光試紙條檢測AFP最佳定量判讀時間為20 min。

2.5 PBA-QBs熒光試紙條檢測AFP的標(biāo)準(zhǔn)曲線

PBA-QBs熒光免疫層析試紙條檢測AFP的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖8所示。在濃度為0.98～31.25 ng mL-1的范圍內(nèi)，F(xiàn)IT/FIC值隨AFP濃度的增加而線

Concentration of AFP mAbs on T line/(mg·mL-1)(a)T線上AFP抗體(包被)噴涂濃度對FIT的影響

Volume of PBA-QB probes/μL(b)PBA-QB免疫探針用量對FIT的影響

t/min(c)PBA-QBs熒光試紙條FIT、FIC和FIT/FIC的免疫動力學(xué)曲線圖7 試紙條制備及檢測條件優(yōu)化

AFP concentration/(ng·mL-1)圖8 PBA-QBs 熒光試紙條定量檢測AFP的標(biāo)準(zhǔn)曲線

性增大。其線性方程為y=0.020 9x+0.039 3(R2=0.992 4)，最低檢測限(LOD)為0.45 ng mL-1，表明PBA-QBs熒光試紙條對AFP具有優(yōu)異的檢測性能。

2.6 PBA-QBs熒光試紙條準(zhǔn)確性評價

批內(nèi)、批間加標(biāo)實驗結(jié)果如表1所示，PBA-QBs熒光試紙條檢測AFP的批內(nèi)回收率介于91.0%～106.6%之間，CV值介于3.65%～6.92%之間；批間回收率介于91.2%～107.1%之間，CV值介于4.75%～ 10.42%之間。該結(jié)果表明，本研究建立的PBA-QBs熒光試紙條檢測AFP的方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。PBA-QBs熒光試紙條穩(wěn)定性測試結(jié)果表明，測試期間試紙條的FIT/FIC值穩(wěn)定(CV<4.3%)，說明該試紙條有較好的檢測穩(wěn)定性。

表1 血清加標(biāo)回收實驗結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了一種簡單的基于PBA-PMAO的表面硼酸功能化PBA-QBs的制備方法。該微球既可與抗體簡便、快速地定向偶聯(lián)，又因量子點含量高而具有很強的熒光信號，是一種優(yōu)良的免疫探針制備材料。將其與AFP單克隆抗體結(jié)合制備高抗體活性的熒光免疫層析檢測探針用于定量檢測血清中的AFP，效果良好。