歐陽錦，羅 亭，余石群，黃邵鑫，汪 鑫

(1.南昌大學(xué)江西省預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330006；2.九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院精準(zhǔn)預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江西 九江 332000)

肺癌是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率呈上升趨勢[1]。其癥狀多出現(xiàn)較晚，確診時(shí)已處病變的晚期，發(fā)現(xiàn)于晚期的非小細(xì)胞肺癌患者的5年生存率平均只有14%，而接受治療的I期患者的5年生存率可達(dá)83%[2]。因此，提高肺癌早期診斷率是改善肺癌患者預(yù)后的重要方法?；赥NM分期，目前非小細(xì)胞肺癌患者的5年生存率估計(jì)在IA期的73%到Ⅳ期的13%之間[3]。TNM分期仍然是臨床肺癌復(fù)發(fā)率和生存率的預(yù)測依據(jù)，但目前對肺癌患者的確診和病變范圍(國際TNM分類/分期)的判斷仍必須通過活檢來確認(rèn)[4]。影像學(xué)結(jié)果在肺癌臨床分期的準(zhǔn)確分類上存在潛在的缺陷和局限性[5]，如CT影像用于肺結(jié)節(jié)的檢測雖具有一定的價(jià)值，然而很難準(zhǔn)確判斷肺結(jié)節(jié)的性質(zhì)[6]。近來，采用免疫組織化學(xué)、突變圖譜和微陣列方式對腫瘤個(gè)體進(jìn)行分析已應(yīng)用于腫瘤臨床分期領(lǐng)域[7]。例如，癌胚抗原、神經(jīng)元特異性烯醇化酶等分子標(biāo)志物已被應(yīng)用于臨床檢測，然而其靈敏度和特異度有限[8]，很少應(yīng)用于肺癌早期診斷中。

基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO)是來自高通量微陣列實(shí)驗(yàn)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的公共存儲(chǔ)庫[9]。借助該數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學(xué)工具挖掘腫瘤的分子標(biāo)志物，可縮短對腫瘤標(biāo)志物的研究時(shí)間，節(jié)約研究成本?；贑T掃描的附加診斷標(biāo)志物的開發(fā)證實(shí)可用于肺癌分期預(yù)測[6]。在臨床環(huán)境中，評(píng)估選定的潛在基因表達(dá)可使臨床醫(yī)生能夠根據(jù)每個(gè)人的遺傳物特征在影像結(jié)節(jié)大小的基礎(chǔ)上做出更準(zhǔn)確的分期診斷，并在總體存活率、進(jìn)展時(shí)間和治療反應(yīng)方面顯著改善治療效果[10]。本研究從GEO中篩選2個(gè)肺癌相關(guān)芯片數(shù)據(jù)集，通過分析建立一個(gè)基于影像分析結(jié)果(肺結(jié)節(jié)最大直徑≤3 cm)的基因研究網(wǎng)絡(luò)，篩選確定與肺癌診斷密切相關(guān)的基因，建立診斷模型和預(yù)測列線圖。

1 資料與方法

1.1 資料

以“肺癌”“TNM”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，從GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫下載肺癌隊(duì)列的基因表達(dá)譜和CT信息。以GSE13213數(shù)據(jù)為訓(xùn)練隊(duì)列，從肺癌患者中納入54例小結(jié)節(jié)(T1期，最大直徑≤3cm)患者；以GSE43580數(shù)據(jù)為驗(yàn)證隊(duì)列，共入選38例小結(jié)節(jié)(T1期，最大直徑≤3 cm)肺癌患者。按其分期分為2組：早期(Ⅰ期)組和中晚期(Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期)組[11]。預(yù)測模型構(gòu)建流程見圖1。

圖1 診斷預(yù)測模型分析流程圖

1.2 方法

1.2.1 肺癌分期的差異表達(dá)基因分析

以|log2FC|>1和P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，用R4.0.3軟件中的LIMMA軟件包進(jìn)行肺癌分期的差異表達(dá)基因分析。使用在線工具ClustVis(https://biit.cs.ut.ee/clustvis/)繪制熱圖和火山圖。將獲得的差異表達(dá)基因分別導(dǎo)入在線軟件draw Venn diagrams(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，獲得2個(gè)隊(duì)列取交集后的重疊差異(共差異)基因及韋恩圖。

利用Metascape對訓(xùn)練隊(duì)列中差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)與KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome)功能分析。GO分析為涵蓋分子和細(xì)胞生物學(xué)眾多領(lǐng)域的基因注釋提供了結(jié)構(gòu)化和受控的詞匯表和分類[12]。利用String數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)的基因構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，在Cytoscape軟件中可視化。

1.2.2 肺癌分期的預(yù)測基因篩選及分析

在共差異基因的基礎(chǔ)上，利用R軟件進(jìn)行基因分析、分類預(yù)測和比較，并篩選區(qū)分早、中晚期肺癌的預(yù)測基因。利用受試者工作特征曲線(ROC)分析這些預(yù)測基因的診斷價(jià)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)的基因

差異表達(dá)基因分析結(jié)果顯示，54例訓(xùn)練隊(duì)列和38例驗(yàn)證隊(duì)列分別獲得161個(gè)和437個(gè)與肺癌分期相關(guān)的差異表達(dá)基因。訓(xùn)練隊(duì)列中，與中晚期組比較，早期組107個(gè)基因表達(dá)上調(diào)和54個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。基因表達(dá)的熱圖見圖2A。驗(yàn)證隊(duì)列中，與中晚期組比較，早期組193個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，244個(gè)基因表達(dá)下調(diào)?；虮磉_(dá)的熱圖見圖2B。在2隊(duì)列中，2組的基因表達(dá)模式不同?；虮磉_(dá)的火山圖，見圖2C和圖2D。韋恩圖比較2個(gè)隊(duì)列的基因差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有7個(gè)重疊(共)差異表達(dá)基因。見圖2E。

2.2 差異表達(dá)基因的功能富集

訓(xùn)練隊(duì)列中161個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋的結(jié)果顯示，這些基因的功能分為3類即生物過程(圖3A)、分子功能(圖3B)和細(xì)胞成分(圖3C)。在這3個(gè)類別中，差異表達(dá)基因主要富集的條目分別是“含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)”“受體調(diào)節(jié)活性”和“腺體發(fā)育”。

A:訓(xùn)練隊(duì)列熱圖；B:驗(yàn)證隊(duì)列熱圖;圖2 基因差異表達(dá)分析

C:訓(xùn)練隊(duì)列火山圖；D:驗(yàn)證隊(duì)列火山圖；E：韋恩圖(左為高表達(dá)；右為低表達(dá))。

訓(xùn)練隊(duì)列的差異基因進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，所有差異表達(dá)基因主要富集于4類通路即谷胱甘肽代謝、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、造血細(xì)胞譜系和膽汁分泌(圖3D)?！鞍┌Y通路”是谷胱甘肽代謝中最大的一組，其次是“谷胱甘肽代謝”和“肝細(xì)胞癌”。

A：GO富集：生物過程；B：GO富集：分子功能；C：GO富集：細(xì)胞成分；D：KEGG富集。圖3 訓(xùn)練隊(duì)列差異表達(dá)基因的功能富集結(jié)果

2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示了重要的模塊，其中度值表示節(jié)點(diǎn)的大小。這些包括了在模塊中識(shí)別的所有重要的蛋白質(zhì)。該模塊由141條邊定義，涉及82個(gè)節(jié)點(diǎn)。SOX2、CCND1、AR、CD19、BMP2、WNT3a、NR0B2、C8A、CD38、FGG、ITIH2、HPGDS和POU2AF1是連接最高的節(jié)點(diǎn)。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析見圖4。

圖4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析模型圖

2.4 與肺癌相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)分析

單因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，在訓(xùn)練隊(duì)列2組的7個(gè)共差異表達(dá)基因中，盡管基因SLC16A14和LHX2在訓(xùn)練隊(duì)列2組間存在差異，但在2個(gè)隊(duì)列中的表達(dá)模式不同，故其在該研究中不具價(jià)值；年齡、性別2組中亦無顯著差異(均P>0.05)；基因ZNF257表達(dá)與肺癌的病理分期相關(guān)，訓(xùn)練隊(duì)列(OR=2.26；95%CI：1.29～3.96)、驗(yàn)證隊(duì)列(OR=1.44、95%CI：0.99～2.10)?；騍OX2、KCNJ16和GSTA1的表達(dá)與肺癌分期呈負(fù)相關(guān)。見表1。

表1 基線資料及單因素Logistic回歸分析

2.5 預(yù)測模型的診斷風(fēng)險(xiǎn)值分析

基于4個(gè)基因(SOX2，KCNJ16，GSTA1和ZNF257)建立的全模型線性回歸方程在訓(xùn)練和驗(yàn)證隊(duì)列中分別為AUC=-5.225 02-0.725 56×SOX2-0.231 60×KCNJ16-0.550 36×GSTA1+1.400 61×ZNF257和AUC=3.450 09-0.398 41×SOX2-0.379 06×KCNJ16-0.038 51×GSTA1+0.350 74×ZNF257。ROC分析結(jié)果顯示，訓(xùn)練隊(duì)列中全模型的靈敏度為83.3%，特異度為92.9%，AUC值為0.917；在驗(yàn)證隊(duì)列中全模型的靈敏度為85.7%，特異度為87.5%，AUC為0.836。見表2。

表2 肺癌病理分期風(fēng)險(xiǎn)值預(yù)測

2.6 小結(jié)節(jié)肺癌中晚期預(yù)測列線圖

進(jìn)一步研究構(gòu)建了一個(gè)包含4個(gè)基因的診斷列線圖(圖5)。如圖所示，基于LOG轉(zhuǎn)化后的ZNF257、SOX2、KCNJ16和GSTA1基因表達(dá)值位于每個(gè)變量軸上。例如，在小結(jié)節(jié)肺癌患者中，如果SOX2基因表達(dá)值為-3，則可以從SOX2軸到點(diǎn)條畫一條向上的垂直線，以獲得45分。其他指標(biāo)也可以這樣操作，假設(shè)GSTA1表達(dá)值為-4時(shí)的得分為50分，KCNJ16表達(dá)值為-1時(shí)的得分為15分，ZNF257表達(dá)值為2時(shí)的得分為70分，即總分為180分(45分+50分+15分+70分)。最后，小結(jié)節(jié)肺癌中晚期的風(fēng)險(xiǎn)約為90%。

圖5 預(yù)測肺小結(jié)節(jié)患者中晚期風(fēng)險(xiǎn)列線圖

3 討論

腫瘤分子標(biāo)志物的確定在肺癌早期診斷中具有重要意義。前期研究[13]發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤基因(P53、NY-ESO-1、Survivin、c-myc、Cyclin B1、GBU4-5、CAGE、P16、SOX2和HUD)的自身抗體在腫瘤診斷中表現(xiàn)出很好的特異性，但其敏感性均較差。此外，EarlyCDT?-Lung測試[14]檢測了7種腫瘤相關(guān)自身抗體即P53、NY-ESO-1、CAGE、GBU4-5、HUD、MAGEA4和SOX2，發(fā)現(xiàn)其特異性達(dá)90%但僅識(shí)別47%的肺癌。雖然，自身抗體的組合可提高診斷的敏感性，但又會(huì)影響其特異性。因此，有必要開發(fā)具有更高的敏感性和特異性的肺癌早期診斷方法。

本研究的診斷模型預(yù)測是基于GEO數(shù)據(jù)庫中的CT診斷結(jié)果(結(jié)節(jié)直徑≤3 cm)，篩選確定與肺癌診斷密切相關(guān)的基因。在納入的小結(jié)節(jié)肺癌患者中，通過Logistic回歸分析和多變量分析，獲得由4個(gè)差異表達(dá)的基因(ZNF257、SOX2、KCNJ16和GSTA1)組成的可用于診斷的預(yù)測模型。該模型的特異度和靈敏度分別為92.9%、83.8%，其模型預(yù)測的靈敏度明顯高于傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物[15]。而且納入的基因數(shù)量少，易于操作。本研究結(jié)果還顯示，ZNF257表達(dá)上調(diào)和SOX2、KCNJ16、GSTA1表達(dá)下調(diào)均與肺癌惡性程度增加有關(guān)。細(xì)胞因子SOX2調(diào)控著細(xì)胞的自我更新和分化[16]。GSTA1可能是肺癌早期診斷和治療的靶分子[17]。已有研究[18]證實(shí)KCNJ16表達(dá)下調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，但其在腫瘤進(jìn)展中的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制仍有待探討。其余的基因ZNF257尚未被報(bào)道與癌癥有關(guān)，還需要進(jìn)一步研究它們的生物學(xué)功能[19]。值得注意的是，通路富集分析表明，包括GSTA1在內(nèi)的3個(gè)下調(diào)的基因與藥物代謝-細(xì)胞色素P450通路、腫瘤發(fā)生和化學(xué)致癌通路密切相關(guān)[20]。此外，本研究基于這4個(gè)基因繪制了一個(gè)便于臨床使用、準(zhǔn)確度高的診斷列線圖，該圖可預(yù)測CT篩查到的小結(jié)節(jié)肺癌患者的惡性風(fēng)險(xiǎn)。然而，該診斷模型的確切的診斷價(jià)值和穩(wěn)定性，仍需在臨床患者中進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫結(jié)合CT影像結(jié)果獲得了由4個(gè)差異表達(dá)基因組成的診斷模型及診斷預(yù)測列線圖，而且該診斷模型具有較好的特異度和靈敏度，診斷預(yù)測列線圖也具有預(yù)測CT篩查到的小結(jié)節(jié)肺癌，提示其在小結(jié)節(jié)肺癌的早期診斷中具有一定的潛在價(jià)值。