段毅，王坤，王軍英，楊歡歡，趙平平

腦側(cè)支循環(huán)的形成，特別是三級(jí)腦側(cè)支循環(huán)，是一個(gè)血管新生的過(guò)程，對(duì)急性缺血性腦卒中患者病情有一定影響。近年來(lái)，微小RNA(microRNA，miRNA)在各種生理、病理過(guò)程中的作用受到廣泛關(guān)注[1-2]。其中不穩(wěn)定的頸動(dòng)脈斑塊中微小RNA-330-5p(miR-330-5p)過(guò)表達(dá)，可通過(guò)靶向踝蛋白-1參與有癥狀的頸動(dòng)脈狹窄的發(fā)生[3]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p表達(dá)上調(diào)與急性缺血性腦卒中的發(fā)生有關(guān)[4]；血管性癡呆(vascular dementia，VD)患者血清miR-34a與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平存在關(guān)系，而VEGF是血管再生過(guò)程中的關(guān)鍵活性因子[5]。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)急性缺血性腦卒中患者血清miR-330-5p、miR-34a-5p及VEGF水平，分析其與腦側(cè)支循環(huán)分級(jí)的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年7月—2021年1月石家莊市第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療且建立腦側(cè)支循環(huán)的急性缺血性腦卒中患者104例為研究組，根據(jù)數(shù)字減影血管造影(DSA)檢測(cè)腦側(cè)支循環(huán)的開(kāi)放層次分組，一級(jí)側(cè)支循環(huán)亞組36例(一級(jí)亞組，主要由Willis環(huán)血管構(gòu)成)，二級(jí)側(cè)支循環(huán)亞組51例(二級(jí)亞組，眼動(dòng)脈、軟腦膜及其他相對(duì)較小的側(cè)支、側(cè)支吻合支)，三級(jí)側(cè)支循環(huán)亞組17例(三級(jí)亞組，通過(guò)血管生成等產(chǎn)生的新生供血血管)。各亞組間性別、年齡、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙史、心房顫動(dòng)史、抗血小板治療及他汀治療比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。同期納入與急性缺血性腦卒中患者性別、年齡相匹配的健康體檢者40例為健康對(duì)照組，男24例，女16例，年齡41～72(57.82±8.64)歲。研究組與健康對(duì)照組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào)：2019051002)，全部研究對(duì)象或家屬均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

表1 急性缺血性腦卒中患者不同亞組間臨床資料比較 [例

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合“中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018”[6]中的相關(guān)診斷流程及標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)顱腦CT、MR或DSA證實(shí)；②納入對(duì)象從發(fā)病至行DSA時(shí)間≤7 d；③臨床資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重肝、腎功能不全者；②合并腫瘤、血液系統(tǒng)疾病或免疫功能障礙者；③合并冠心病、心力衰竭、心律失常等患者；④同時(shí)存在病灶對(duì)側(cè)大腦中動(dòng)脈或頸內(nèi)動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄或閉塞者；⑤存在CT、MR或DSA禁忌證者；⑥精神狀態(tài)、意識(shí)功能障礙，無(wú)法完成本研究者。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 血清miR-330-5p、miR-34a-5p水平檢測(cè)：研究組患者于入院24 h內(nèi)、健康體檢者于體檢當(dāng)日禁食8～12 h后，采集空腹肘靜脈血5 ml，離心取上層清液于干凈EP管，置于-70℃條件下保存檢測(cè)。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)血清miR-330-5p、miR-34a-5p水平。首先利用Trizol試劑盒(無(wú)錫百泰克生物技術(shù)有限公司)提取血清總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司)得到cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行miR-330-5p、miR-34a-5p擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃變性15 min，94℃ 15 s，退火及延伸60℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-330-5p、miR-34a-5p均以U6為內(nèi)參。引物由無(wú)錫百泰克生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表2。用2-△△Ct法計(jì)算血清miR-330-5p、miR-34a-5p相對(duì)表達(dá)量。

表2 miR-330-5p、miR-34a-5p及U6引物序列

1.3.2 血清VEGF水平檢測(cè)：上述血清，利用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清VEGF水平，人VEGF試劑盒購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平比較 研究組血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平均顯著高于健康對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 健康對(duì)照組與研究組血清miR-330-5p、miR-34a-5p及VEGF水平比較

2.2 急性缺血性腦卒中患者亞組間血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平比較 一級(jí)亞組、二級(jí)亞組、三級(jí)亞組血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平依次升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)，見(jiàn)表4。

表4 急性缺血性腦卒中患者不同亞組間血清miR-330-5p、miR-34a-5p及VEGF水平比較

2.3 血清miR-330-5p、miR-34a-5p與VEGF水平的相關(guān)性 Pearson分析結(jié)果顯示，急性缺血性腦卒中患者血清miR-330-5p、miR-34a-5p與VEGF水平均呈正相關(guān)(r=0.674、0.624，P均=0.000)。

2.4 血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平對(duì)急性缺血性腦卒中患者三級(jí)腦側(cè)支循環(huán)建立的預(yù)測(cè)價(jià)值 以急性缺血性腦卒中一級(jí)、二級(jí)腦側(cè)支循環(huán)患者血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平為對(duì)照，評(píng)估血清指標(biāo)對(duì)三級(jí)腦側(cè)支循環(huán)患者的預(yù)測(cè)價(jià)值，ROC結(jié)果顯示，血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平及三者聯(lián)合預(yù)測(cè)急性缺血性腦卒中患者三級(jí)腦側(cè)支循環(huán)建立的曲線(xiàn)下面積(AUC)分別為0.874、0.903、0.870、0.951，三者聯(lián)合優(yōu)于單獨(dú)預(yù)測(cè)(Z=3.080、2.049、3.240，P=0.002、0.041、0.001)，見(jiàn)圖1、表5。

圖1 血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平對(duì)急性缺血性腦卒中患者三級(jí)腦側(cè)支循環(huán)建立的ROC曲線(xiàn)

表5 血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平對(duì)急性缺血性腦卒中患者三級(jí)腦側(cè)支循環(huán)建立的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討 論

急性缺血性腦卒中是人類(lèi)第二大常見(jiàn)死亡原因，其發(fā)病率隨年齡的增長(zhǎng)而逐漸增加，是導(dǎo)致長(zhǎng)期身體殘疾的重要原因，給患者帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)[7-9]。大腦血管網(wǎng)絡(luò)的存在或缺失越來(lái)越被認(rèn)為是腦卒中的重要預(yù)后原因，而傳統(tǒng)上的研究多集中于血管再通的各個(gè)方面，很少關(guān)注腦側(cè)支循環(huán)的作用[10-12]。腦側(cè)支循環(huán)是指當(dāng)腦部供血?jiǎng)用}嚴(yán)重狹窄或閉塞時(shí)，血液可通過(guò)側(cè)支或新形成的血管吻合到達(dá)缺血區(qū)，使缺血區(qū)域得到不同程度的灌注代償[13-15]。既往研究發(fā)現(xiàn)[16-17]，多種基因和蛋白參與急性缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展，其對(duì)腦側(cè)支循環(huán)的作用目前知之甚少。

miRNA主要在轉(zhuǎn)錄后通過(guò)miRNA的互補(bǔ)序列識(shí)別并靶向mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)參與調(diào)控基因表達(dá)[18-19]。腦內(nèi)主要側(cè)支通路是Willis環(huán)的后、前交通(側(cè)支)動(dòng)脈，前、中、后大腦動(dòng)脈樹(shù)冠間的pial小動(dòng)脈吻合及小腦后動(dòng)脈與小腦上動(dòng)脈、小腦遠(yuǎn)端動(dòng)脈之間的穹窿吻合，有助于減輕缺血癥狀，保護(hù)神經(jīng)元功能[20]。有報(bào)道稱(chēng)，miR-330-5p在神經(jīng)系統(tǒng)中靶向細(xì)胞分裂周期蛋白42(CDC42)表達(dá)，參與阿爾茨海默病發(fā)病過(guò)程中神經(jīng)元對(duì)抗突觸缺失的代償作用[21]。腦側(cè)支循環(huán)的形成，尤其是三級(jí)腦側(cè)支循環(huán)，實(shí)際上是血管新生的結(jié)果。已有研究證實(shí)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)可促進(jìn)冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)的形成，減輕冠狀動(dòng)脈慢性全閉塞患者遠(yuǎn)端血管的缺血和心絞痛癥狀，保留患者心室功能[22-23]。本結(jié)果顯示，急性缺血性腦卒中患者血清miR-330-5p、VEGF水平較健康體檢者高，隨著患者腦側(cè)支循環(huán)分級(jí)增加，血清miR-330-5p、VEGF水平逐漸升高，且二者表達(dá)呈正相關(guān)，提示血清miR-330-5p水平可能參與急性缺血性腦卒中患者腦側(cè)支循環(huán)的形成過(guò)程，可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化有關(guān)，具體作用機(jī)制尚不清楚。

內(nèi)皮細(xì)胞衰老被認(rèn)為是血腦屏障完整性受損的主要原因，衰老機(jī)制包括內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、動(dòng)脈硬化和內(nèi)皮細(xì)胞微囊釋放[24]。miRNA在細(xì)胞衰老、血管內(nèi)皮損傷中的作用越來(lái)越受到關(guān)注[25-26]。國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道稱(chēng)，VD患者血清miR-34a表達(dá)升高，VEGF水平降低，二者水平呈負(fù)相關(guān)，可能導(dǎo)致VD患者病情加重[5]，與本研究結(jié)果不同。本研究結(jié)果顯示，急性缺血性腦卒中患者血清miR-34a-5p水平較健康對(duì)照組高，隨著患者腦側(cè)支循環(huán)分級(jí)增加，血清miR-34a-5p水平呈逐漸上升趨勢(shì)，且與VEGF水平呈正相關(guān)，與王御林等[5]研究相似，表明miR-34a-5p可能通過(guò)協(xié)同VEGF，參與急性缺血性腦卒中腦側(cè)支循環(huán)形成過(guò)程。推測(cè)可能的原因是VEGF是一種多向性血管生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)急性缺血性腦卒中新生血管生成[27]，腦側(cè)支循環(huán)的形成即新毛細(xì)血管的形成，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌大量VEGF參與內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)，加上患者血腦屏障功能受損，VEGF進(jìn)入血液可被檢測(cè)到。而VD患者由于病情較為嚴(yán)重，血管修復(fù)功能降低，VEGF分泌減少，可作為反映腦血管疾病嚴(yán)重程度的一種生物指標(biāo)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平均對(duì)急性缺血性腦卒中患者三級(jí)腦側(cè)支循環(huán)的建立有一定的診斷價(jià)值，且三者聯(lián)合診斷效能更高，可能作為預(yù)測(cè)急性缺血性腦卒中患者腦側(cè)支循環(huán)分級(jí)的潛在生物標(biāo)志物。

綜上所述，血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平隨急性缺血性腦卒中患者腦側(cè)支循環(huán)分級(jí)增加而呈上升趨勢(shì)，miR-330-5p、miR-34a-5p均與VEGF水平呈正相關(guān)，推測(cè)血清miR-330-5p、miR-34a-5p可能參與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化，有利于血管新生，具體作用機(jī)制尚待更深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

段毅：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫(xiě)；王坤：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；王軍英：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改；楊歡歡：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；趙平平：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫(xiě)