陳海濱，趙建軍，程小龍，譚超

腎癌又稱腎細(xì)胞癌，約占每年新發(fā)成人惡性腫瘤的3%，是最常見的惡性腫瘤之一，且其發(fā)病率在過去的幾十年一直呈現(xiàn)不斷上升的趨勢[1-2]。腎細(xì)胞癌最常見的組織類型為腎透明細(xì)胞癌，約占腎細(xì)胞癌的85%[3]。腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，但研究表明，基因甲基化可能與其發(fā)生、發(fā)展有一定聯(lián)系[4]。內(nèi)皮PAS區(qū)域蛋白1(endothelial PAS domain protein 1，EPAS-1)又稱缺氧誘導(dǎo)因子2，與腫瘤血管生成及預(yù)后具有密切聯(lián)系，是惡性腫瘤的獨立預(yù)后因素[5]。雖然缺氧誘導(dǎo)因子在腎細(xì)胞癌中的研究較多[6-7]，但關(guān)于EPAS-1基因甲基化及蛋白表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌的關(guān)系研究仍較少。因此，現(xiàn)分析EPAS-1基因甲基化及蛋白表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為腎透明細(xì)胞癌基因治療提供新的靶點，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年2月—2015年8月于河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外二科診治腎透明細(xì)胞癌患者86例的癌組織為研究對象(腎透明細(xì)胞癌組)，男52例，女34例，年齡46～76(59.92±11.49)歲。選取其癌旁正常組織作為癌旁對照組。(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)影像學(xué)檢查、臨床特征及病理證實確診為腎透明細(xì)胞癌患者，符合腎透明細(xì)胞癌診療指南[8]；②病歷資料齊全者；③術(shù)前未接受過放療、化療等輔助治療。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①有嚴(yán)重精神障礙者；②合并其他惡性腫瘤或有惡性腫瘤史者；③合并其他感染性疾病及嚴(yán)重肝、腎功能異常者；④已參與其他臨床試驗或因其他原因不能參與本試驗者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)[審批號：2014(K)020]，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 試劑與材料 (1)試藥試劑：DNA抽提試劑盒(德國QIAGEN公司)，CpGenome DNA Modification Kit(德國Merck Millipore公司)，DAB顯色試劑盒(武漢純度生物科技有限公司)，EPAS-1抗體(武漢益普生物科技有限公司)，PTG19-T載體(上海信帆生物科技有限公司)，XL-10 Gold感受態(tài)細(xì)胞(上海烜雅生物科技有限公司)；(2)儀器設(shè)備：PCR儀(美國Bio-Rad公司)，紫外分光光度計(美國Thermo Fisher公司)，顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 樣品采集及保存：術(shù)中采集患者腎透明細(xì)胞癌組織及其癌旁正常組織，一部分置于-80℃保存用于提取DNA；一部分10%甲醛固定標(biāo)本后，進(jìn)行梯度脫水、透明、浸蠟、包埋及切片(厚度4 μm)。

1.3.2 EPAS-1基因甲基化測定：DNA抽提試劑盒提取腎透明細(xì)胞癌組織及其癌旁正常組織基因組DNA，紫外分光光度計檢測DNA純度。DNA純度檢測后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系共50 μl：模板DNA(50 ng/μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1 μl，2×PCR Mix 25 μl，雙蒸水(ddH2O) 21 μl。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性6 min,94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，75 ℃ 40 s，40個循環(huán)。由上海生工生物工程股份有限公司合成引物及測序，甲基化數(shù)據(jù)用BIQ Analyzer軟件分析和整理。EPAS-1甲基化引物序列上游：5＇-GAGTAGGAAGGGTATAAGG-3＇，下游：5＇-TCCCGAAGTTAGAGGGACCA-3＇；非甲基化引物序列上游：5＇-GGTTGTCGTATACCTGGACT-3＇，下游：5＇-GTTGTCCGCCTACCTTCTGAAG-3＇。以2-△△CT法計算EPAS-1基因甲基化水平。

1.3.3 EPAS-1蛋白水平檢測：采用免疫組織化學(xué)法檢測組織EPAS-1蛋白表達(dá)水平。將切片脫蠟、水化及抗原熱修復(fù)(乙二胺四乙酸二鈉緩沖液100℃)；滴加過氧化物酶阻斷溶液，并采用動物非免疫血清室溫封閉；滴加一抗EPAS-1(1∶50稀釋)，陰性對照為聚丁二酸丁二醇酯(PBS)緩沖液；生物素標(biāo)記的二抗進(jìn)行室溫孵育后滴加鏈霉菌抗生物素—過氧化物酶溶液；PBS緩沖液沖洗后，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢，之后采取半定量法進(jìn)行評分。雙盲進(jìn)行結(jié)果判定，每張切片分別由2名病理科醫(yī)師判讀，每個標(biāo)本取2次觀察評分的平均值。按染色強(qiáng)度計分：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淺黃色為1分，無色為0分；按照陽性細(xì)胞率計分，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)≥76%，51%～75%，26%～50%，6%～25%，≤5%分別判定為4、3、2、1、0分。將上述2項得分相乘，總分<5分為陰性(-)，≥5分為陽性(+)。

1.3.4 隨訪情況：手術(shù)后5年內(nèi)采用電話、入戶和患者入院復(fù)查等方式進(jìn)行隨訪，術(shù)后第1～3年每3～6個月隨訪1次，4～5年每6個月隨訪1次。其生存期從手術(shù)之日起計算，隨訪截至2020年8月31日。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以頻數(shù)或率(%)表示，組間比較行χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法分析腎透明細(xì)胞癌患者EPAS-1甲基化水平及蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，用Log-rank進(jìn)行生存曲線顯著性檢驗，采用多因素Cox回歸分析影響腎透明細(xì)胞癌預(yù)后的因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組EPAS-1基因甲基化狀態(tài)及蛋白表達(dá)比較 腎透明細(xì)胞癌組EPAS-1基因甲基化率為62.79%(54/86)，顯著高于癌旁對照組的16.28%(14/86)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2/P=38.914/0.000)。腎透明細(xì)胞癌組EPAS-1蛋白表達(dá)陽性率為23.26%(20/86)，顯著低于癌旁對照組的65.12%(56/86)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2/P=30.553/0.000)，見圖1。

癌旁正常組織 腎透明細(xì)胞癌組織

2.2 癌組織EPAS-1基因甲基化水平及蛋白表達(dá)在不同臨床/病理特征中比較 不同性別、年齡、WHO/ISUP分級患者中癌組織EPAS-1基因甲基化率及蛋白表達(dá)陽性率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；腫瘤直徑≥4.0 cm、Fuhrman分級高級別癌組織EPAS-1甲基化率高于腫瘤<4.0 cm、Fuhrman分級低級別患者(P<0.01)，蛋白表達(dá)陽性率低于腫瘤<4.0 cm、Fuhrman分級低級別患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 腎透明細(xì)胞癌患者癌組織EPAS-1基因甲基化水平及蛋白表達(dá)在不同臨床/病理特征中比較 [例(%)]

2.3 癌組織EPAS-1基因甲基化水平及蛋白表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier法結(jié)果顯示，EPAS-1基因甲基化腎透明細(xì)胞癌患者5年生存率51.85%(28/54)，低于EPAS-1基因非甲基化患者的78.13%(25/32)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.865，P=0.015)；EPAS-1蛋白陽性表達(dá)腎透明細(xì)胞癌患者5年生存率85.00%(17/20)，高于EPAS-1蛋白陰性表達(dá)患者的54.55%(36/66)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.020，P=0.014)。

2.4 影響腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析 EPAS-1基因甲基化是影響腎透明細(xì)胞癌患者死亡的獨立危險因素(P<0.01)，EPAS-1蛋白陽性表達(dá)是影響腎透明細(xì)胞癌患者死亡的保護(hù)因素(P<0.01)，見表2。

表2 影響腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

3 討 論

腎細(xì)胞癌早期臨床表現(xiàn)不典型，通過影像學(xué)及病理檢查等確診時，多已屬于晚期，預(yù)后較差[9-10]。對于晚期的腎細(xì)胞癌患者，疾病無法根治，且存在耐藥問題[11-13]。目前關(guān)于腎透明細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物研究較少，因此，尋找切實有效的腎透明細(xì)胞癌腫瘤標(biāo)志物顯得尤為重要。

表觀遺傳學(xué)改變是多種腫瘤的特征，而DNA甲基化驅(qū)動轉(zhuǎn)錄調(diào)控是表觀遺傳的重要組成，也是腫瘤細(xì)胞中一些功能基因沉默或失活的常見機(jī)制[14-15]。已有研究表明，DNA甲基化在腎透明細(xì)胞癌中發(fā)揮重要作用[16]。EPAS-1是細(xì)胞和組織缺氧的主要轉(zhuǎn)錄因子，在低氧引起的酶或因子變化中起到重要作用[17]。EPAS-1主要在低氧區(qū)域誘導(dǎo)表達(dá)，同時調(diào)節(jié)腫瘤為適應(yīng)低氧狀態(tài)所必需的基因表達(dá)，進(jìn)而在血管生長、能量代謝、腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用[18]。目前關(guān)于EPAS-1與腎透明細(xì)胞癌病理學(xué)參數(shù)、預(yù)后的關(guān)系及其在腎透明細(xì)胞癌中的差異表達(dá)均尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，與癌旁對照組相比，腎透明細(xì)胞癌組EPAS-1基因甲基化率顯著升高，EPAS-1蛋白表達(dá)陽性率顯著降低，與成永忠等[19]研究結(jié)果中EPAS-1的作用相似。提示EPAS-1基因啟動子高甲基化及蛋白低表達(dá)可能與腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。此外，本研究中癌組織EPAS-1基因甲基化、蛋白表達(dá)與腫瘤直徑及Fuhrman分級有關(guān)，提示EPAS-1基因甲基化可能參與腎透明細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移等過程，且基因甲基化可能多發(fā)生于腫瘤≥4.0 cm、Fuhrman分級高級別的腎透明細(xì)胞癌患者。Xu等[20]研究顯示，EPAS-1啟動子甲基化可降低EPAS-1 mRNA在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)水平。本研究5年生存分析及影響因素結(jié)果提示，EPAS-1基因發(fā)生甲基化及蛋白低表達(dá)可能不利于患者預(yù)后。結(jié)合既往研究，推測可能機(jī)制為：缺氧時穩(wěn)定的EPAS-1反式激活，進(jìn)一步促進(jìn)EPAS-1啟動子的特異性甲基化，其甲基化可能導(dǎo)致EPAS-1基因在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)失活，進(jìn)而使得EPAS-1蛋白無法參與細(xì)胞周期的調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞迅速生長，腎透明細(xì)胞癌患者病情加重，死亡幾率增加。

綜上所述，EPAS-1基因甲基化及蛋白表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌的臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)，對EPAS-1基因甲基化的研究可能為今后尋找更多的腎透明細(xì)胞癌腫瘤分子生物學(xué)標(biāo)志物起到積極的推動作用。然而本研究檢測甲基化過程中有可能會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，進(jìn)而可能會造成研究結(jié)果存在一定的偏倚，有待今后采用更先進(jìn)的檢測技術(shù)、納入更多樣本進(jìn)一步深入探究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

陳海濱：提出研究方向、研究思路，研究選題，設(shè)計論文框架，撰寫論文；趙建軍：設(shè)計研究方案、研究流程，論文撰寫；程小龍：實施研究過程，數(shù)據(jù)收集，分析整理試驗數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；譚超：進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研與整理，論文修改