趙小勤，黃曉婧，羅 霄，高 鵬，許 莉

不同部位和不同產(chǎn)地加工方法的知母質(zhì)量評價研究

趙小勤，黃曉婧，羅 霄，高 鵬，許 莉*

成都市藥品檢驗研究院 國家藥監(jiān)局中藥材質(zhì)量監(jiān)測評價重點實驗室，四川 成都 610045

采用UPLC-QQQ-MS/MS法同時測定不同部位和不同產(chǎn)地加工方法知母中9個成分的含量，并比較其差異。采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為0.01%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，體積流量0.4 mL/min，進樣量2 μL，柱溫30 ℃；質(zhì)譜采用電噴霧離子源、負離子模式（ESI?），多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）。知母中新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷E1、知母皂苷I 9個成分在各自范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，加樣回收率97.23%～100.76%。知母的5個不同部位中知母須根中芒果苷、異芒果苷的含量最高；知母肉中知母皂苷E1、知母皂苷BII、知母皂苷I含量最高；知母頭與知母片、知母肉成分差異較小。比較知母的不同產(chǎn)地加工方法，趁鮮切片新芒果苷和知母皂苷BII的含量較高，潤切片芒果苷和知母皂苷AIII的含量較高。知母須根具有一定的開發(fā)利用價值，知母肉具有其存在的合理性；知母產(chǎn)地加工，可不切去知母頭，以減少工序，提高知母根莖的綜合利用率；趁鮮切片可加速干燥，降低飲片霉變風(fēng)險。

知母；UPLC-QQQ-MS/MS；新芒果苷；芒果苷；異芒果苷；知母皂苷AII；知母皂苷AIII；知母皂苷BII；知母皂苷BIII；知母皂苷E1；知母皂苷I

知母為百合科植物知母Bge.的干燥根莖[1]，入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]。知母苦寒質(zhì)潤、滋清兼?zhèn)洌瑸橹匾膫鹘y(tǒng)大宗藥用品種之一，古代經(jīng)典名方桂枝芍藥知母湯、玉女煎、升陷湯、達原飲、二冬湯等均含知母[3]。

目前藥典收載的知母產(chǎn)地加工方法為：采挖新鮮知母的根莖，除去須根及泥沙，曬干，習(xí)稱“毛知母”；或除去外皮，曬干，習(xí)稱“知母肉”[4]；“毛知母”或“知母肉”藥材經(jīng)中藥材飲片公司收購再潤切炮制成飲片（以下簡稱“潤切片”），但因栽培知母根莖較肥大且富含黏液質(zhì)，完全曬干需數(shù)月，此間知母內(nèi)部極易腐敗變質(zhì)，嚴重影響其安全性和有效性。經(jīng)產(chǎn)地調(diào)研發(fā)現(xiàn)[5]，隨著產(chǎn)地加工機械化水平的不斷提高，近年來在栽培知母主產(chǎn)地安徽亳州十九里鎮(zhèn)和河北安國興起趁鮮切片的加工方法，該方法可實現(xiàn)知母的快速干燥，有效避免內(nèi)部質(zhì)量變壞。但趁鮮切片和傳統(tǒng)潤切片相比，其內(nèi)部有效成分有何變化，目前尚未見報道。栽培知母須根較為發(fā)達，其須根量是根莖采收量的30%左右[6]，在產(chǎn)地加工時作為非藥用部位常被棄之不用，造成了大量的資源浪費和環(huán)境污染；經(jīng)實地調(diào)研，在知母趁鮮切片時，藥農(nóng)常把知母根莖頂部較嫩部位（以下簡稱“知母頭”）也切去不用；在加工知母肉的時候，外皮作為非藥用部位被除去不用。但筆者在產(chǎn)地調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，栽培知母主產(chǎn)區(qū)不少藥農(nóng)將這些非藥用部位收集起來售賣給收購商，其流向和用途未知。這些知母的非藥用部位與藥用部位有效成分有何差異？有無藥用價值？是否可以作為資源開發(fā)利用？是值得思考的問題?，F(xiàn)代研究認為，知母中最主要的生物活性物質(zhì)群為甾體皂苷和雙苯吡酮類成分[9-11]，其具有抗炎[12-15]、抗血小板聚集[16-18]、降血糖[19-20]、調(diào)血脂[21-22]、改善老年癡呆癥患者的學(xué)習(xí)和記憶能力[23-25]等藥理活性。本實驗基于UPLC-QQQ-MS-MS法，同時測定知母不同部位和不同產(chǎn)地加工方法的甾體皂苷類（知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷E1、知母皂苷I）和雙苯吡酮類（新芒果苷、芒果苷、異芒果苷）9個成分的含量，并結(jié)合多元變量統(tǒng)計分析軟件對結(jié)果進行分析，探尋知母不同部位和不同產(chǎn)地加工方法的物質(zhì)成分差異，以期為合理加工和綜合利用知母資源提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1290型超高效液相色譜儀、6470三重四級桿質(zhì)譜儀、MassHunter工作站（Agilent公司，美國）；可變速高速旋轉(zhuǎn)粉碎機（FRITSCH公司，德國）；BAO-80A精密鼓風(fēng)干燥箱（施都凱儀器設(shè)備上海有限公司），ME240E電子天平（Mettler Toldeo公司，瑞士）；XPE26電子天平（Mettler Toldeo公司，瑞士）；SK250H超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；Milli-Q Advantage A10 型超純水儀（Millipore公司，美國）。

1.2 材料

對照品芒果苷（批號111607-201503，質(zhì)量分數(shù)98.4%）、知母皂苷BII（批號111839-201505，質(zhì)量分數(shù)94.4%）對照品購自中國食品藥品檢定研究院；新芒果苷（批號16042232，質(zhì)量分數(shù)99.73%）、異芒果苷（批號MUST16100905，質(zhì)量分數(shù)99.81%）、知母皂苷AII（批號MUST16112415，質(zhì)量分數(shù)99.59%）、知母皂苷AIII（批號MUST16020108，質(zhì)量分數(shù)98.78%）、知母皂苷BIII（批號MUST17022210，質(zhì)量分數(shù)96.93%）、知母皂苷E1（批號MUST17031401，質(zhì)量分數(shù)99.15%）、知母皂苷I（批號MUST16112412，質(zhì)量分數(shù)99.43%）對照品均購自成都曼斯特生物科技有限公司。

乙腈為色譜純，德國Merck公司；甲酸為質(zhì)譜級，美國Fisher公司；水為實驗室自制超純水。知母藥材樣品均為實地采集，經(jīng)成都市食品藥品檢驗研究院羅霄副主任中藥師鑒定為百合科知母Bge.的根及根莖，樣品信息見表1、2。

表1 5批不同部位的知母樣品

表2 7批不同產(chǎn)地加工方法的知母樣品

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的處理

2.1.1 不同部位知母樣品處理 分別取表1中同一株知母，剪下須根（知母須，部位1），將剩余部位隨機分為3份；第1份切取根莖頂部3 cm，切片（知母頭，部位2）；第2份整體切片（知母片，部位3）；第3份刮取知母皮（知母皮，部位4），將去皮的知母根莖切片（知母肉，部位5）。所有樣品60 ℃烘干（水分含量低于11%），打粉，過三號篩，備用。

2.1.2 不同產(chǎn)地加工方法知母樣品處理 取表2中每批知母，隨機分為2份，一份趁鮮切片，60 ℃烘干（以下簡稱“鮮切片”）；一份自然曬干（毛知母），取一半毛知母灑水噴淋軟化潤切為知母片（毛知母潤切片，以下簡稱“潤切片”），60 ℃烘干。所有樣品，打粉，過三號篩，備用。

2.2 色譜和質(zhì)譜條件[26]

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫30 ℃；流動相為0.01%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序：0～3 min，93% A；3～7.5 min，93%～87% A；7.5～8 min，87%～78% A；8～11 min，78%～65% A；11～12.5 min，65%～55% A；12.5～18 min，55%～20% A；18～20 min，20%～5% A；體積流量0.4 mL/min；進樣量為2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI）；負離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣體積流量：8 L/min；霧化器壓力：25 psi（1 psi＝6.895 kPa）；離子源噴霧電壓：3 000 V；EMV：750。各成分質(zhì)譜參數(shù)見表3?；旌蠈φ掌啡芤?、供試品溶液的總離子流圖見圖1。

2.3 對照品儲備液的制備

精密稱取新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷E1、知母皂苷I對照品適量，分別加50%甲醇配制成2.054、1.568、1.591、1.528、1.931、3.247、1.534、3.157、3.874 mg/mL的對照品儲備液，在4 ℃下避光保存。

表3 9種成分的質(zhì)譜參數(shù)

*為定量碎片離子

*quantitative fragment ion

1-新芒果苷 2-芒果苷 3-異芒果苷 4-知母皂苷E1 5-知母皂苷BII 6-知母皂苷BIII 7-知母皂苷I 8-知母皂苷AII 9-知母皂苷AIII

2.4 供試品溶液的制備

取本品粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液0.1 mL置50 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.5 線性關(guān)系、最低檢出限（LOD）和最低定量限（LOQ）

分別精密吸取新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷E1、知母皂苷I對照品儲備液適量，置同一量瓶中，加50%甲醇逐級稀釋成系列對照品溶液，精密吸取2 μL，按“2.2”項色譜和質(zhì)譜條件進行測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（），相應(yīng)峰面積為縱坐標（）作線性回歸，繪制標準曲線。逐步稀釋對照品溶液，以信噪比（/）3為LOD，/10為LOQ，結(jié)果見表4。

表4 9種成分線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、LOD和LOQ

2.6 精密度試驗

取同一對照品溶液連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷E1、知母皂苷I峰面積的RSD分別為0.68%、0.98%、1.21%、1.25%、0.45%、0.96%、1.51%、2.19%、1.83%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一樣品（BW3，知母片）6份，按“2.4”項下方法平行制備供試品溶液，進樣。測得新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷E1、知母皂苷I的質(zhì)量分數(shù)平均值分別為37.97、8.47、1.43、0.31、1.65、62.35、2.83、2.85、3.41mg/g，RSD值分別為0.65%、0.78%、1.23%、1.37%、1.05%、0.84%、1.24%、0.95%、0.67%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于0、4、8、16、24 h，按“2.2”項色譜和質(zhì)譜條件進行分析，測得新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷E1、知母皂苷I的峰面積，RSD值分別為0.25%、0.38%、1.25%、0.87%、1.32%、0.58%、1.01%、1.35%、1.24%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已測定9種成分含量的同一知母樣品9份，每份取約0.1 g。取新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷E1、知母皂苷I對照品適量配制成適當(dāng)質(zhì)量濃度的對照品溶液，以樣品中各成分量的50%、100%、150%加入樣品粉末中，平行制備3份，按照“2.4”項下方法制備供試品溶液，進樣分析。結(jié)果新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷E1、知母皂苷I的平均回收率分別為99.87%、98.15%、97.23%、98.65%、100.76%、99.24%、98.43%、98.37%、97.53%，RSD值分別為1.67%、1.78%、2.33%、1.49%、1.85%、1.75%、2.14%、2.61%、2.57%。

2.10 樣品測定

分別精密稱取各批次知母樣品粉末，每批約0.2 g，依照“2.4”項所述方法制備供試品溶液，每批平行制定3份，精密吸取供試品溶液2 μL，按“2.2”項測定條件進行分析，以標準曲線法分別計算各樣品中新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷E1、知母皂苷I的含量，結(jié)果見表5、6。

表5 5批不同部位知母的樣品含量測定結(jié)果(n＝3)

表6 7批不同產(chǎn)地加工方法的樣品含量測定結(jié)果(n＝3)

2.11 樣品測定結(jié)果統(tǒng)計分析

本研究以知母中9個化學(xué)成分的含量為變量，采用多元變量統(tǒng)計分析軟件SIMCA 14.1對2.9項下結(jié)果采用正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）建立分析模型（圖2、3）。從圖2可看出，不同部位知母樣品知母頭、知母肉、知母片聚為一類，知母須和知母皮各聚為一類，表明知母須與知母皮較接近，而與其他部位差異較大。為進一步顯示知母不同部位樣品中化學(xué)成分的含量特征，繪制了不同部位9種化學(xué)成分的平均含量雷達圖，見圖4。由于各成分含量存在一定差異，將各成分含量乘以相應(yīng)系數(shù)進行修正，具體系數(shù)：新芒果苷為3、芒果苷為8、異芒果苷為30、知母皂苷E1為20、知母皂苷BII為1、知母皂苷BIII為40、知母皂苷I為15、知母皂苷AII為265、知母皂苷AIII為20。

圖2 不同部位OPLS-DA得分散點圖

圖3 不同產(chǎn)地加工方法OPLS-DA得分散點

由圖4可見，知母須中新芒果苷、知母皂苷AIII、知母皂苷E1、知母皂苷BIII、知母皂苷BII、知母皂苷I 6個成分含量在5個部位中最低，其中3批未檢出具有重要藥理活性的主要化學(xué)成分知母皂苷BII；但其芒果苷、異芒果苷含量在5個部位中最高。知母皮中新芒果苷、知母皂苷AIII、知母皂苷E1、知母皂苷BII、知母皂苷I的含量在5個部位中僅比知母須高，比知母頭、知母肉、知母片都低。而去皮去須的知母肉中知母皂苷E1、知母皂苷BII、知母皂苷I含量在5個部位中最高。由圖3可見，不同產(chǎn)地加工方法的知母樣品鮮切片聚為一類，毛知母和潤切片聚為一類。為進一步顯示知母不同產(chǎn)地加工樣品中化學(xué)成分的含量特征，繪制了不同產(chǎn)地加工方法知母樣品中9種化學(xué)成分的平均含量雷達圖，見圖5。由于各成分含量存在一定差異，將各成分含量乘以相應(yīng)系數(shù)進行修正，具體系數(shù)：新芒果苷為8，芒果苷為4，異芒果苷為20，知母皂苷E1為25，知母皂苷BII為1，知母皂苷BIII為12，知母皂苷I為10，知母皂苷AII為65，知母皂苷AIII為4。由圖5可知，鮮切片中新芒果苷、知母皂苷BII、知母皂苷E1三者含量較毛知母、潤切片高，而其余成分均較毛知母、潤切片中低。

圖4 不同部位各成分平均含量雷達圖

3 討論

知母須中新芒果苷、知母皂苷AIII、知母皂苷E1、知母皂苷BIII、知母皂苷BII、知母皂苷I等6個成分含量在5個部位中最低，其中3批未檢出具有抗氧化[28-29]、抗血栓[16]、抗抑郁[30]、抗炎[31-32]等重要藥理活性的主要化學(xué)成分知母皂苷BII，可見知母須在產(chǎn)地加工中作為非藥用部位棄去具有一定的合理性；但其芒果苷、異芒果苷含量在5個部位中最高，芒果苷也為知母具有抗炎[31]、降血糖[33]重要藥理活性的主要化學(xué)成分。文獻報道，李麗麗等[7]認為知母須根對糖氧剝奪損傷的PC12細胞具有保護作用，廖振東等[8]從知母須根中發(fā)現(xiàn)一個新的二苯甲酮類化合物并認為該化合物具有對H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷的神經(jīng)保護活性。因此，知母須具有一定的開發(fā)利用價值，可考慮用于芒果苷提取、開發(fā)成方制劑以及保健品等。知母皮化學(xué)成分含量與知母須較接近，而與知母頭、知母肉、知母片差異較大；其所含新芒果苷、知母皂苷BII等多個成分含量在5個部位中僅比知母須高，比知母頭、知母肉、知母片都低。而去皮去須的知母肉中知母皂苷E1、知母皂苷BII、知母皂苷I含量在五個部位中最高，其中知母皂苷BII在9個成分中含量最高且具有重要的藥理活性成分，因此，知母肉的加工方法具有其存在的合理性。知母皮為加工知母肉的廢棄物，因加工知母肉需耗費大量人力，產(chǎn)生的知母皮數(shù)量極少，不具備開發(fā)利用的規(guī)模。因知母頭與知母片差異較小，筆者認為在加工過程可不必切去知母頭，以減少工序，提高知母根莖的綜合利用率。

圖5 不同產(chǎn)地加工方式各成分平均含量雷達圖

對不同產(chǎn)地加工方法的知母樣品進行分析發(fā)現(xiàn)，新芒果苷的含量：鮮切片＞毛知母＞潤切片；芒果苷的含量：潤切片＞毛知母＞鮮切片。筆者前期對188批知母樣品中新芒果苷、芒果苷含量與水分進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明高含水率的情況下，新芒果苷容易轉(zhuǎn)化為芒果苷[27]。筆者認為，鮮切片因迅速脫水干燥，新芒果苷含量高，芒果苷含量低；新鮮知母曬干變?yōu)槊高^程脫水緩慢，故部分新芒果苷轉(zhuǎn)化為芒果苷；毛知母灑水噴淋軟化潤切為飲片過程中含水率提高，部分新芒果苷轉(zhuǎn)化為芒果苷。經(jīng)筆者前期文獻調(diào)研，芒果苷、知母皂苷BII、知母皂苷AIII為知母中重要的藥理活性成分[26]，這三者也是知母中含量較高的化學(xué)成分。知母皂苷BII的含量：鮮切片＞毛知母≈潤切片，知母皂苷AIII的含量：潤切片＞毛知母＞鮮切片。鮮切片新芒果苷和知母皂苷BII的含量高，潤切片芒果苷和知母皂苷AIII的含量高，其他5個成分變化無規(guī)律，因此，僅從9種化學(xué)成分的含量多少的角度無法評價2種產(chǎn)地加工方法的優(yōu)劣。但鮮切片干燥迅速，不容易發(fā)霉變質(zhì)，飲片質(zhì)量和安全性更有保障，筆者建議采用趁鮮切片的產(chǎn)地加工方法，如用于治療糖尿病等需芒果苷含量較高的飲片，可通過改變生產(chǎn)工藝如增加知母飲片的浸泡時間等嘗試實現(xiàn)，如何優(yōu)化知母產(chǎn)地加工方法和提取工藝，有待進一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality evaluation offor different parts and different processing methods

ZHAO Xiao-qin, HUANG Xiao-jing, LUO Xiao, GAO Peng, XU Li

Chengdu Institute for Drug Control, NMPA Key Laboratory for Quality Monitoring and Evaluation of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610045, China

To determine the contents of 9 components infor different parts and different processing methods by UPLC-QQQ-MS/MS method,and compared the differences.The sample were separated on an Waters ACQUITY UPLC BEH C18column(100 mm × 2.1mm,1.7 μm), the mobile phase composed of 0.01% formic acid solution (A) - acetonitrile (B) with gradient elution.the flow rate was 0.4 mL/min and the injection volume was 2 μL.The column temperature was 30 ℃.Multiple-reaction monitoring（MRM）scanning was employed for quantification in negative ion mode under electrospray ion.The nine components (neomangiferin, mangiferin, isomangiferin, timosaponin E1,timosaponin BII,timosaponin BIII,anemarrhenasaponin I,timosaponin AII and timosaponin AIII) all showed good linear relationship in their respective ranges,the average recoveries of 9 components were 97.23%—100.76%.Among the five different parts of,the contents of mangiferin and isomangiferin were the highest in the fibrous root of, the contents of timosaponin E1, timosaponin BII and anemarrhenasaponin I inwith outer cork removed (called zhimurou) were the highest,there was little difference in the components among the apex in rhizome of(called zhimutou), Anemarrhenae Rhizoma pieces and zhimurou.Compared the different habitat processing methods of, the content of neomangiferin and imosaponin BII were higher in fresh-cut slices, while the content of mangiferin and timosaponin AIII were higher in traditional-cut slices.The fibrous root ofis valuable in development and utilization, and the existence of zhimurou is rational.Zhimutou can be reserved in the habitat processing ofin order to reduce the working procedure and improve the comprehensive utilization rate of the rhizome of.Fresh-cut slices can accelerate drying and reduce the risk of mildew.

; UPLC-QQQ-MS/MS; neomangiferin; mangiferin; isomangiferin; timosaponin E1; timosaponin BII; timosaponin BIII; anemarrhenasaponin I; timosaponin AII; timosaponin AIII

R286.2

A

0253 - 2670(2021)22 - 6990 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.026

2021-05-06

2017年國家藥品計劃抽驗項目（中檢監(jiān)督函<2017>61號，中央補助地方經(jīng)費項目）

趙小勤（1987—），女，主管中藥師，碩士，從事中藥材鑒定、中藥質(zhì)量分析。Tel: (028)85362592 E-mail: 358235392@qq.com

通信作者：許 莉（1987—），女，副主任中藥師，博士，從事中藥品質(zhì)評價研究。Tel: (028)85362592 E-mail: xulicd1987@sina.com

[責(zé)任編輯 時圣明]