王源源，丁 鵬

（北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700）

絞股藍為多年生草質藤本植物，始載于《救荒本草》，又名七葉膽、福音草、遍地生根、天堂草、五葉參、七葉參、超人參等[1-2]。據(jù)《香港中藥材標準》（第5期）記載，絞股藍來源于葫蘆科植物絞股藍Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino的干燥地上部分。生長于山谷密林（海拔100～3 200 m）、山坡疏林及灌叢中，在陜西、甘肅和長江以南各地廣泛分布[3]。有清熱解毒、益氣健脾、養(yǎng)陰生津、化痰止咳、養(yǎng)心安神之功效，用于治療體虛乏力、虛勞失精、白細胞減少、高脂血、病毒性肝炎、慢性胃腸炎、慢性氣管炎等病癥，也比較適合肥胖和長期疲勞的人群，近年來被冠以“南方人參”和“第二人參”的美譽[4-6]。絞股藍藥材中含有絞股藍皂苷、黃酮類、絞股藍糖苷、微量元素、維生素、礦物質等多種化學成分，目前普遍認為達瑪烷型四環(huán)三萜皂苷和黃酮是其兩大主要有效成分[7-10]。現(xiàn)代藥理研究表明[11-13]，以絞股藍皂苷A、絞股藍皂苷XLIX為代表的皂苷類成分和以蘆丁和槲皮素為代表的黃酮類成分均具有抑制腫瘤生長、降低血糖、保護心腦血管系統(tǒng)、減少氧化應激、調(diào)節(jié)血脂平衡等作用。

近年來，國內(nèi)學者主要對絞股藍藥材中黃酮類或皂苷類成分分別進行指紋圖譜、化學成分或藥理作用的研究，但僅以其中單一成分對絞股藍的質量進行評價，難以體現(xiàn)中藥多成分、多靶標協(xié)同作用的整體性，而相關研究報道鮮見?！吨腥A人民共和國藥典》（2015版）未收載絞股藍藥材相關標準，部分地方中藥材標準對其質量的全面控制還不夠完善，而藥材的質量易受多方面因素（如品種、產(chǎn)地、氣候、生態(tài)環(huán)境、不同批次及不同產(chǎn)地等）的影響。故本試驗將通過HPLC-UVELSD串聯(lián)指紋圖譜和定量分析法綜合評價不同產(chǎn)地絞股藍藥材的質量，以期能整體上控制其質量，為絞股藍藥材臨床使用的有效性和穩(wěn)定性提供實驗支持。

1 實驗材料

1.1 儀器Agilent1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），包括UV檢測器，四元梯度泵，軟件Empower Pro色譜工作站；Alltech3300型蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）（格雷斯中國有限公司）；Milli Pore Advantage A10型自動純水機（美國密理博公司）；KQ5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XS205DU型電子分析天平（瑞士梅勒特有限公司）。

1.2 試藥 對照品包括蘆丁（批號：100080-201610，純度≥91.9%）、槲皮素（批號：100081-201408，純度≥99.1%）、絞股藍皂苷A（批號：157752-01-7，純度≥98.0%）、絞股藍皂苷XLIX（批號：94987-08-3，純度≥98.0%）均購于中國食品藥品檢定研究院；流動相乙腈和甲醇（色譜級）；蒸餾水（屈臣氏）。其余試劑為分析純。不同產(chǎn)地絞股藍Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino藥材共15批均購買藥材市場或藥店，見表1。

表1 15批絞股藍藥材來源信息

1.3 觀察指標與方法 觀察指標：（1）HPLC-UV-ELSD研究絞股藍藥材指紋圖譜：研究15批不同產(chǎn)地絞股藍藥材的共有模式；（2）測定絞股藍藥材中槲皮素、蘆丁、絞股藍皂苷A和絞股藍皂苷XLIX 4種成分的含量。檢測方法：（1）HPLC-UV-ELSD指紋圖譜研究：色譜條件為Thermo BDS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；乙腈（A）-0.5%乙酸水（B）溶液為流動相；梯度洗脫程序為：0～10 min，10%（A），10～18 min，10%→20%（A），18～40 min，20%→45%（A），40～55 min，45%→60%（A），55～70 min，60%→100%（A）；檢測波長為360 nm；柱溫為30℃；ELSD漂移管溫度為80℃，載氣流量為1.5 L/min；進樣量為10 μL，流速為1.0 mL/min。分別精密稱取蘆丁、槲皮素、絞股藍皂苷A和絞股藍皂苷XLIX適量對照品，置于5 mL的棕色量瓶中，緩緩滴加甲醇溶液至刻度定容溶解，制備的混合對照品溶液終濃度分別為蘆丁0.256 mg/mL、槲皮素0.131 mg/mL、絞股藍皂苷A 0.142 mg/mL、絞股藍皂苷XLIX 0.185 mg/mL。然后，稱取絞股藍藥材（過65目篩）約2.0 g，精密稱重后，置索氏提取器中，加石油醚（60～90℃）適量，加熱回流提取至無色，冷卻，棄去石油醚液，揮干溶劑。再次加入甲醇80 mL，進行4 h的回流提取，冷卻后加甲醇定容稀釋至100 mL，搖勻，所有樣品進樣前需過0.45 μm的微孔濾膜。（2）含量測定：在指紋圖譜研究的基礎上同時定量分析4種成分的含量，精密吸取各對照品母液，稀釋配制一系列濃度的混合對照品溶液，按已定的高效液相色譜條件進樣分析，對照品峰面積（A）為縱坐標（Y），進樣量（ng）為橫坐標（X），根據(jù)建立的標準曲線，計算得出各指標性成分的線性回歸方程。

2 結 果

2.1 HPLC-UV-ELSD指紋圖譜研究結果

2.1.1 精密度試驗 取重復性試驗中的同一供試品溶液連續(xù)6次進樣，參照峰為4號（蘆?。┓?，分別計算11個共有峰的相對保留時間RSD和相對峰面積RSD。結果顯示，各個共有峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD均小于2.0%，并且各共有指紋峰的相似度均大于0.990，表明高效液相色譜儀的精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗 取重復性試驗中的同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣分析，參照峰為4號（蘆?。┓?，分別計算11個共有峰的相對保留時間RSD和相對峰面積RSD。結果顯示，各個共有峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD均小于2.0%，并且各共有指紋峰的相似度均大于0.990，表明本次實驗制備的供試品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.1.3 重復性試驗 精密稱取6份過65目篩的絞股藍樣品（S1）2.0 g，樣品溶液按照已定的方法制備，過濾進樣分析，參照峰為4號（蘆?。┓?，分別計算11個共有峰的相對保留時間RSD和相對峰面積RSD。結果顯示，各個共有峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD均小于2.0%，并且各共有指紋峰的相似度均大于0.990，表明本次實驗方法的重復性良好。

2.1.4 HPLC-UV-ELSD指紋圖譜的建立及其相似度分析 分別精密吸取10 μL的對照品溶液及樣品溶液，進樣分析，記錄15批不同來源絞股藍藥材在70 min內(nèi)的HPLC-UV-ELSD串聯(lián)色譜圖。比對混合對照品色譜圖中各色譜峰的保留時間，結果指認了峰3為槲皮素，峰4為蘆丁，峰6為絞股藍皂苷XLIX，峰8為絞股藍皂苷A。最后以AIA格式將15批絞股藍藥材的HPLC-UV-ELSD指紋色譜圖導入軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（A版）》中，樣品S1設為參照圖譜，采用中位數(shù)對照圖譜生成法，時間窗寬度設為0.2，指紋共有峰的疊加圖譜分別如圖1和圖3所示，自動生成的對照指紋圖譜分別見圖2～4，參照峰為4號（蘆?。┓?。最后確定了絞股藍樣品中有11個共有特征峰，其共有峰相對保留時間RSD分別為0.65%、0.68%、0.73%、0.00%、0.12%、0.55%、0.31%、0.76%、0.82%、0.67%、0.93%及相對峰面積RSD分別為10.23%、12.35%、13.63%、0.00%、11.53%、9.54%、10.27%、13.29%、15.82%、13.72%、10.70%。15批的絞股藍樣品與對照指紋圖譜的相似度計算結果分別為0.999、0.990、0.991、0.989、0.986、0.995、0.992、0.993、0.991、0.995、0.996、0.988、0.987、0.990、0.990。

圖1 15批絞股藍藥材HPLC-UV指紋圖譜

圖2 15批絞股藍藥材HPLC-UV對照指紋圖譜

圖3 15批絞股藍藥材HPLC-ELSD對照指紋圖譜

圖4 15批絞股藍藥材HPLC-ELSD對照指紋圖譜

2.2 4 種成分的定量分析結果

2.2.1 線性關系考察 按已定的分析方法進樣分析，繪制標準曲線，最后分別計算得線性回歸方程為槲皮素Y1=4 502.7X1+38 912（r1=0.999 9）；蘆丁Y2=2 532.7X2+24 623（r2=0.999 8）；絞股藍皂苷AY3=6 477.7X3+47 010（r3=0.999 9）；絞股藍皂苷XLIXY4=6 482.7X4+47 720（r4=0.999 8）。結果表明，4種指標性成分在相應的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關系。

2.2.2 精密度試驗 取重復性試驗中的同一供試品溶液連續(xù)進樣6次。結果顯示，含量RSD分別為槲皮素1.13%、蘆丁1.25%、絞股藍皂苷A 1.05%和絞股藍皂苷XLIX 0.97%，表明本次試驗所用的高效液相色譜儀的精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣。結果顯示，含量RSD分別為槲皮素0.33%、蘆丁0.49%、絞股藍皂苷A 0.72%和絞股藍皂苷XLIX 0.35%，表明試驗制備的供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復性試驗 分別精密稱取6份過65目篩的絞股藍藥材粉末（S1）2.0 g，按照已定的樣品制備方法進樣分析檢測。結果表明，槲皮素、蘆丁、絞股藍皂苷A和絞股藍皂苷XLIXRSD分別為1.04%、0.55%、0.86%、1.13%，表明本次試驗方法的重復性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 分別精密稱取9份過65目篩的絞股藍藥材粉末（S1）樣品0.1 g，將其平均分為3組（即50%、100%、150%），按已定樣品制備方法進行制備，根據(jù)峰面積（A）計算平均加樣回收率，結果顯示，4種成分的平均加樣回收率分別為槲皮素102.0%（RSD=1.27%）、蘆丁98.5%（RSD=1.15%）、絞股藍皂苷A 101.5%（RSD=0.89%）、絞股藍皂苷XLIX 100.9%（RSD=0.99%）。

2.2.6 含量測定結果 取過65目篩的15批絞股藍藥材粉末，按已定方法制備和進樣分析，分別計算藥材中4種成分的含量，結果見表2。4種成分總含量高低順序為：湖北十堰＞陜西平利＞陜西平利＞湖北神農(nóng)架＞陜西龍西＞云南昆明＞安徽亳州＞安徽亳州＞云南昆明＞福建古田＞安徽亳州＞廣西桂林＞安徽亳州＞福建古田＞安徽亳州。結果表明，湖北和陜西產(chǎn)地的絞股藍藥材含量均高于4.0%，可以歸為Ⅰ類；云南、廣西、福建、安徽產(chǎn)地的絞股藍含量均低于4.0%，可以歸為Ⅱ類。

表2 15批絞股藍藥材中4種成分的含量（%，n=3）

3 討 論

3.1 提取方式考察 試驗過程中還考察了不同提取方式對絞股藍樣品的提取效率，包括超聲波提取、索氏加熱回流提取、水浴加熱回流提取，結果顯示，索氏回流提取法所得色譜圖的色譜峰信息較豐富，故試驗選取索氏回流提取方法；查閱文獻知[14-16]，絞股藍中可能含有大量的脂溶性成分，因此實驗結合黃酮類成分（槲皮素、蘆?。┖驮碥疹惓煞郑ńg股藍皂苷A、絞股藍皂苷XLIX）的化學性質對提取溶劑，即石油醚（60～90℃）、三氯甲烷、甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇進行了考察，結果表明先以石油醚（60～90℃）除去干擾較大的脂溶性成分，再以甲醇為提取溶媒時色譜峰的豐度較好、基線較平穩(wěn)、雜峰較少；對索氏回流提取時間，即提取1、2、4、6、8 h進行考察，結果顯示索氏回流提取4 h即可提取完全。

3.2 色譜條件確定 本次實驗通過全波長掃描（190～400 nm），最終選取最大吸光度360 nm作為本次實驗的紫外檢測波長；通過考察Agilent TC-C18、Thermo BDS C18和Agilent SB C18不同型號及不同廠家色譜柱，甲醇-0.1%乙酸水溶液、甲醇-0.5%乙酸水溶液、乙腈-0.5%乙酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液和甲醇-水溶液不同流動相系統(tǒng)，25℃、30℃和40℃不同色譜柱柱溫，0.8、1.0和1.2 mL/min不同流速，60℃、70℃和80℃不同漂移管溫度。綜合實驗結果，最終選取Thermo BDS C18柱為本次實驗的色譜柱、乙腈-0.5%乙酸水溶液為流動相、流速為1.0 mL/min、柱溫為30℃、80℃的漂移管溫度，在此條件下樣品具有較豐富的色譜信息、平穩(wěn)的基線、較高的豐度、較少的雜峰、平滑對稱的峰形及較好的分離度。

3.3 小結 本次試驗評價了15批不同產(chǎn)地絞股藍藥材的質量，結果建立了不同產(chǎn)地絞股藍藥材的HPLC-UV-ELSD指紋圖譜，鑒定了共有特征峰11個，通過與對照品比對，指認了其中4個成分。在指紋圖譜研究的基礎上，同時定量分析了4個指標性成分的含量。由定量分析結果可知，不同產(chǎn)地絞股藍藥材中槲皮素、蘆丁、絞股藍皂苷A和絞股藍皂苷XLIX的含量參差不齊，整體來看，不同產(chǎn)地絞股藍樣品中4種成分含量從高到低分別為：蘆丁、絞股藍皂苷A、絞股藍皂苷XLIX和槲皮素。其中蘆丁的平均含量約是槲皮素平均含量的10倍，差異較明顯；黃酮類成分的總量是皂苷類成分的1.2倍，兩大類成分總含量整體上相差不大。從產(chǎn)地上看，陜西和湖北產(chǎn)的絞股藍藥材質量較優(yōu)，其他產(chǎn)地次之。本次試驗建立的HPLC-UVELSD指紋圖譜與多指標性成分定量分析方法簡單、可靠，可作為絞股藍藥材質量的綜合評價的方法之一，同時也為下一步建立完善的絞股藍藥材質量標準提供實驗依據(jù)。