李武平，李 婕，易 南，黃思琦，劉宗義，朱付平

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙 湖南 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 湖南 410208）

肢體缺血-再灌注損傷（limb ischemia-reperfusion injury，LIRI）是肢體缺血損傷和再灌注損傷的合稱，其常繼發(fā)于動(dòng)脈損傷、動(dòng)脈栓塞、斷肢再植、帶血管蒂組織移植、骨筋膜室綜合征、重建手術(shù)、不當(dāng)止血帶應(yīng)用等方面。自1985年Mc Cord提出缺血-再灌注損傷的概念后[1]，逐漸被學(xué)術(shù)界公認(rèn)并不斷地深入研究，相較于對心、肝、腦、腎等重要器官缺血-再灌注損傷的研究方面，學(xué)術(shù)界對骨骼肌缺血-再灌注損傷的研究相對較少，然而骨骼肌對缺血十分敏感，文獻(xiàn)報(bào)道顯示阻斷肢體血流2.5 h后復(fù)灌就會引起肢體缺血-再灌注損傷[2]。LIRI可致肢體骨骼肌壞死攣縮而致殘，嚴(yán)重者甚至引起全身多器官功能衰竭而致死亡[3]。醫(yī)學(xué)界多認(rèn)為其與脂質(zhì)過氧化、氧自由基損傷、鈣離子代謝紊亂、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)損害等有關(guān)，但LIRI的分子病理機(jī)制尚不明確，亦缺乏特異并且有效的治療方法[4-5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/Ca2+信號通路在大鼠LIRI鈣離子代謝及炎癥反應(yīng)方面起著至關(guān)重要的作用[6]。桃紅四物湯源自清代吳謙《醫(yī)宗金鑒》，是活血化瘀經(jīng)典方劑之一，臨床上也常用于各種嚴(yán)重創(chuàng)傷所致潛在LIRI風(fēng)險(xiǎn)，并取得了滿意療效[7]。課題組前期研究顯示桃紅四物湯預(yù)處理可減少大鼠LIRI骨骼肌細(xì)胞凋亡[8]，同時(shí)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)缺氧再給氧誘導(dǎo)損傷的大鼠骨骼肌細(xì)胞中，Wnt5a、IP3R、CaMKⅡ等蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而桃紅四物湯預(yù)處理后可以通過調(diào)控Wnt/Ca2+信號通路Wnt5a/IP3R/CaMKⅡ途徑來減輕肢體缺血-再灌注損傷[9]。Wnt5a作為Wnt信號通路中重要的上游信號分子，在大鼠體內(nèi)的表達(dá)變化情況值得進(jìn)一步研究，因此本研究制備LIRI骨骼肌損傷大鼠模型，以Wnt5a阻滯劑作為陽性對照，觀察桃紅四物湯干預(yù)對Wnt5a表達(dá)變化的影響，從Wnt/Ca2+信號通路角度進(jìn)一步探討大鼠LIRI骨骼肌損傷機(jī)制及桃紅四物湯的干預(yù)機(jī)制，旨在為豐富LIRI的病理機(jī)制和防治方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡SPF級SD雄性大鼠100只，體質(zhì)量（230±10）g，購自湖南長沙SLAC景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2016-0002，動(dòng)物使用許可證號：SYXK（湘）2019-0002。大鼠在湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的無病原體設(shè)施中常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度20～25℃、相對濕度50%～70%，光照12 h。本實(shí)驗(yàn)已通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會審查，倫理審查批號：HN-LL-GZR-201609；動(dòng)物福利按照國際相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物法規(guī)實(shí)施。

1.2 藥物與試劑 桃紅四物湯，方藥組成：桃仁15 g，紅花15 g，熟地黃10 g，赤芍10 g，當(dāng)歸10 g，川芎10 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑科結(jié)合現(xiàn)代工藝加工制成藥液，規(guī)格：250 mL/瓶，質(zhì)量濃度：0.15 g/mL原料藥，批號：20160408；FZR5（美國Sigma公司，批號：20160206，規(guī)格：20 μg/mL）；0.25%胰蛋白酶-EDTA（北京索來寶科技有限公司，批號：T1350）；抗Wnt5a（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：BS4773）；Trizol[愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易（上海）有限公司，批號：15596-026]；Rever Tra Ace qPCR RT試劑盒（東洋紡上海生物科技有限公司，批號：FSQ101）；SYBRPremix Ex TaqTM（perfect real-time）試劑盒（大連寶生物工程公司，批號：DRR420A）；大鼠IL-1β ELISA檢測試劑盒（批號：ab100772）、大鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒（批號：ab100785）（英國Abcam公司）。

1.3 主要儀器GL16M臺式高速冷凍離心機(jī)（長沙科威實(shí)業(yè)有限公司，型號：TGL20M）；BD-180S雙門冷凍柜（青島海爾冰箱通用有限公司，型號：BC/BD-318HD）；NIS Elements F3.0軟件（日本東京尼康，型號：AR/BR/D）；Image Pro plus version 6.0（美國Media Cybernetics公司）；酶標(biāo)儀（上海培奧分析儀器有限公司，型號：PO-9622A）；7500實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司，型號：7500）。

1.4 動(dòng)物分組與造模 將100只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、桃紅四物湯低劑量組、桃紅四物湯高劑量組、阻滯劑組，每組20只。除正常組大鼠不阻斷血流外，其他4組均根據(jù)課題組前期造模方法[10]，用塑料套管和市售橡皮筋阻斷SD大鼠右后肢血流4 h后，再解除阻斷恢復(fù)下肢血流灌的注，制備大鼠肢體缺血-再灌注損傷模型；阻斷大鼠后肢血流4 h后，大鼠趾掌變得蒼白青紫、發(fā)涼，擠壓足趾無毛細(xì)血管充盈反應(yīng)，患肢主動(dòng)活動(dòng)明顯受限，被動(dòng)牽拉患肢大鼠掙扎躲避，提示造模成功。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 桃紅四物湯低、高劑量組大鼠于造模前3 d開始灌胃給予桃紅四物湯，2次/d，造模前2 h再給藥1次，每只大鼠給藥共7次，具體給藥劑量根據(jù)所測體質(zhì)量通過體表面積-劑量換算法，計(jì)算得出大鼠每天桃紅四物湯的等效劑量為1.35 g/kg，F(xiàn)ZR5大鼠的等效劑量為87 μg/kg；桃紅四物湯低、高劑量分別設(shè)置為等效劑量的1、2倍，即桃紅四物湯低劑量組大鼠每日給藥劑量為1.35 g/kg，桃紅四物湯高劑量組為2.70 g/kg，阻滯劑組在造模前2 h予以腹腔注射FZR5，87 μg/kg；正常組和模型組大鼠在同樣的時(shí)間點(diǎn)給予相同體積蒸餾水灌胃。

1.6 觀察指標(biāo) 在缺血再灌注0、2、4、8 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各組隨機(jī)選取5只大鼠，3%戊巴比妥鈉（1.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，仰臥位固定在自制大鼠手術(shù)臺上，右側(cè)后肢相應(yīng)的區(qū)域剪毛，復(fù)合碘消毒，沿右側(cè)后肢長軸方向依次切開皮膚、皮下組織、深筋膜，充分顯露腓腸肌肌腹組織，切取腓腸肌100 mg，迅速冰鹽水洗凈血液，濾紙吸干水分，剪刀切割剪碎后裝入保存管，置于低溫冰箱（-70℃）保存。

1.6.1 HE染色法行組織病理學(xué)觀察 取復(fù)灌后8 h大鼠部分腓腸肌組織切片，用4%中性甲醛溶液固定，石蠟切片（4 μm）蘇木精染液染色，0.5%冰鹽酸-酒精分化液分化，梯度酒精脫水，50%伊紅液染色，梯度酒精脫水、二甲苯使切片透明后晾干，中性樹膠封片，蓋片，顯微鏡下觀察各組大鼠腓腸肌病理損傷情況并拍照記錄。

1.6.2 ELISA法檢測腓腸肌IL-1β、TNF-α含量 取不需要組織學(xué)檢查的部分腓腸肌組織，轉(zhuǎn)移到勻漿機(jī)中，暴露于蛋白質(zhì)提取液中，在冰浴下勻漿，移入離心管中，15 000 r/min離心30 min，除去沉淀，取上清液于-20℃下保存，分析。取100 μL的樣品，參考TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒操作步驟，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測，取波長450 nm，空白孔校零后，讀取各孔OD值。

1.6.3 RT-qPCR法檢測腓腸肌Wnt5a mRNA表達(dá) 使用Trizol試劑盒、氯仿和異丙醇等試劑，完成總RNA的提取、清洗、溶解、定量及鑒定；用寡核苷酸18引物和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄2 μg總RNA以獲得cDNA，以cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)溶解曲線證實(shí)引物的特異性和結(jié)果的可信度，使用2-ΔΔCT測定靶基因的相對表達(dá)量。其中ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct，ΔΔCt=對照組ΔCt-樣品組ΔCt。引物序列見表1。

表1 基因RT-qPCR引物信息

1.6.4 免疫組化法檢測腓腸肌Wnt5a蛋白的陽性表達(dá) 提取復(fù)灌后8 h的大鼠腓腸肌組織，多聚甲醛固定并切片，3%過氧化氫（H2O2）處理，并與10%山羊血清預(yù)孵育，然后與抗Wnt5a（1∶100）抗體在4℃孵育后，用HRP標(biāo)記的IgG孵育樣品，用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）進(jìn)行顯色反應(yīng)，在顯微鏡下觀察顯色過程。使用NIS Elements F 3.0軟件在200倍放大的光學(xué)顯微鏡下觀察顯色過程并采集圖像。用Image Pro plus version 6.0單盲法測量Wnt5a陽性表達(dá)處的積分光密度（IA）值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 21.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，IL-1β、TNF-α、Wnt5a mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)為符合正態(tài)分布及方差齊的計(jì)量資料，采用重復(fù)測量資料方差分析；Wnt5a蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)為符合正態(tài)分布及方差齊的計(jì)量資料，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腓腸肌病理結(jié)果比較 本實(shí)驗(yàn)所有大鼠在觀察時(shí)間窗內(nèi)均無死亡，正常組大鼠可見腓腸肌肌纖維呈長索狀，肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，肌漿豐富，每一肌纖維內(nèi)表面有多個(gè)緊密附著的細(xì)胞核，胞核大小均勻，著色均勻；模型組大鼠可見腓腸肌肌纖維紊亂、腫脹，大部分肌纖維完整性、連續(xù)性遭到破壞，細(xì)胞核散在稀疏，肌纖維間明顯炎癥細(xì)胞浸潤；阻滯劑組、桃紅四物湯低劑量組、桃紅四物湯高劑量組大鼠大部分腓腸肌肌纖維結(jié)構(gòu)完整、排列整齊，部分肌纖維輕度破壞變薄，部分肌纖維間縫隙增寬，少量炎癥細(xì)胞浸潤。（見圖1）

圖1 各組大鼠腓腸肌染色形態(tài)光鏡圖（HE，×100）

2.2 各組大鼠腓腸肌中IL-1β含量比較 不同再灌注時(shí)間（0、2、4、8 h）之間大鼠腓腸肌中IL-1β含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），不存在時(shí)間效應(yīng)。模型組大鼠腓腸肌中IL-1β含量呈逐漸上升的趨勢，再灌注8 h達(dá)到峰值（P＜0.05）；桃紅四物湯低劑量組大鼠腓腸肌中IL-1β含量呈逐漸下降的趨勢，再灌注8 h為最低值（P＜0.05）；阻滯劑組大鼠腓腸肌中IL-1β含量呈先升高后降低，然后再升高的變化趨勢，再灌注2 h達(dá)到峰值（P＜0.05）。5組大鼠腓腸肌中IL-1β含量總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即存在分組效應(yīng)。模型組大鼠腓腸肌中IL-1β含量高于正常組（P＜0.05）；阻滯劑組、桃紅四物湯低劑量組、桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌中IL-1β含量均低于模型組（P＜0.05）；桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌中IL-1β含量均低于桃紅四物湯低劑量組（P＜0.05）；桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌中IL-1β含量低于阻滯劑組（P＜0.05）。時(shí)間因素與分組因素間存在交互效應(yīng)（P＜0.05）。（見表2、圖2）

表2 各組大鼠腓腸肌中IL-1β含量比較（±s，pg/mL）

表2 各組大鼠腓腸肌中IL-1β含量比較（±s，pg/mL）

注：F交互效應(yīng)=16.088，P交互效應(yīng)=0.000；F時(shí)間主效應(yīng)=0.921，P時(shí)間主效應(yīng)=0.434；F組別主效應(yīng)=3412.524，P組別主效應(yīng)=0.000；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與桃紅四物湯低劑量組比較，cP＜0.05；與阻滯劑組比較，dP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 給藥劑量[g/(kg·d)]0 h 2 h 4 h 8 h F P正常組 5 - 134.26±1.65 134.03±3.69 136.83±5.66 137.53±9.27 1.249 0.298模型組 5 - 256.06±5.87a 261.13±3.26a 270.18±0.99a 272.17±3.81a 22.662 0.000桃紅四物湯低劑量組5 1.35 218.53±0.72ab 213.94±1.21ab 208.36±3.04ab 197.96±2.43ab 30.845 0.000桃紅四物湯高劑量組5 2.70 181.47±2.89abcd 183.85±2.06abcd 187.37±2.24abcd 185.55±0.64abcd 2.473 0.068阻滯劑組 5 8.70×10-5 202.53±0.32ab 206.94±3.10ab 195.98±2.88ab 200.95±2.56ab 8.045 0.000 F 800.653 844.414 900.202 915.520 P 0.000 0.000 0.000 0.000

圖2 IL-1β的交互效應(yīng)輪廓圖

2.3 各組大鼠腓腸肌中TNF-α含量比較 不同再灌注時(shí)間（0、2、4、8 h）之間大鼠腓腸肌中TNF-α含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即存在時(shí)間效應(yīng)，5組均如此。正常組、模型組大鼠腓腸肌中TNF-α含量再灌注后逐漸上升，再灌注4 h達(dá)到峰值，然后均呈下降趨勢（P＜0.05）；桃紅四物湯低劑量組大鼠腓腸肌中TNF-α含量呈逐漸下降的趨勢，再灌注8 h為最低值（P＜0.05）；桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌中TNF-α含量呈逐漸升高的趨勢，再灌注8 h達(dá)到峰值（P＜0.05）；阻滯劑組大鼠腓腸肌中TNF-α含量再灌注后逐漸下降，再灌注2 h達(dá)到最低值，然后呈上升趨勢，再灌注8 h達(dá)到峰值（P＜0.05）。5組大鼠腓腸肌中TNF-α含量總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即存在分組效應(yīng)。模型組大鼠腓腸肌中TNF-α含量高于正常組（P＜0.05）；桃紅四物湯低劑量組、桃紅四物湯高劑量組、阻滯劑組大鼠腓腸肌中TNF-α含量均低于模型組（P＜0.05）；桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌中TNF-α含量低于桃紅四物湯低劑量組（P＜0.05）；桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌中TNF-α含量低于阻滯劑組（P＜0.05）。時(shí)間因素與分組因素間存在交互效應(yīng)（P＜0.05）。（見表3、圖3）

表3 各組大鼠腓腸肌中TNF-α含量比較（±s，pg/mL）

表3 各組大鼠腓腸肌中TNF-α含量比較（±s，pg/mL）

注：F交互效應(yīng)=17.067，P交互效應(yīng)=0.000；F時(shí)間主效應(yīng)=11.319，P時(shí)間主效應(yīng)=0.000；F組別主效應(yīng)=2202.912，P組別主效應(yīng)=0.000；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與桃紅四物湯低劑量組比較，cP＜0.05；與阻滯劑組比較，dP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 給藥劑量[g/(kg·d)]0 h 2 h 4 h 8 h F P正常組 5 - 78.95±0.53 81.58±1.43 82.85±0.72 81.58±0.36 4.253 0.008模型組 5 - 125.30±0.41a 128.99±6.86a 134.45±2.53a 131.47±1.67a 23.725 0.000桃紅四物湯低劑量組5 1.35 112.32±0.32a b 109.17±0.67a b 106.57±0.71a b 102.11±0.85a b 29.451 0.000桃紅四物湯高劑量組5 2.70 86.29±055a b c d 88.22±0.37a b c d 91.73±0.19a b c d 93.83±0.56a b c d 18.228 0.000阻滯劑組 5 8.70×10-5 101.84±0.19a b 101.71±0.38a b 103.07±0.38a b 105.11±0.97a b 3.929 0.011 F 562.483 548.380 605.970 537.279 P 0.000 0.000 0.000 0.000

圖3 TNF-α的交互效應(yīng)輪廓圖

2.4 各組大鼠腓腸肌Wnt5a mRNA表達(dá)比較 不同再灌注時(shí)間（0、2、4、8 h）之間大鼠腓腸肌Wnt5a mRNA表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即存在時(shí)間效應(yīng)。除正常組外，其余各組大鼠再灌注后腓腸肌Wnt5a mRNA表達(dá)均逐漸上升。5組大鼠腓腸肌Wnt5a mRNA表達(dá)總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即存在分組效應(yīng)。與正常組比較，模型組、阻滯劑組、桃紅四物湯高劑量組、桃紅四物湯低劑量組大鼠腓腸肌中Wnt5a mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，阻滯劑組、桃紅四物湯高劑量組、桃紅四物湯低劑量組大鼠腓腸肌中Wnt5a mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；與桃紅四物湯低劑量組比較，桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌中Wnt5a mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；與阻滯劑比較，桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌中Wnt5a mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。時(shí)間因素和組別因素存在交互效應(yīng)（P＜0.05）。（見表4、圖4～5）

表4 各組大鼠腓腸肌Wnt5a mRNA表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠腓腸肌Wnt5a mRNA表達(dá)比較（±s）

注：F交互效應(yīng)=8.209，P交互效應(yīng)=0.000；F時(shí)間主效應(yīng)=73.943，P時(shí)間主效應(yīng)=0.000；F組別主效應(yīng)=555.844，P組別主效應(yīng)=0.000；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與桃紅四物湯低劑量組比較，cP＜0.05；與阻滯劑組比較，dP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 給藥劑量[g/(kg·d)]0 h 2 h 4 h 8 h F P正常組 5 - 28.53±0.16 28.92±0.95 28.72±0.58 27.92±1.22 0.680 0.567模型組 5 - 41.56±1.56a 43.42±1.37a 45.36±1.12a 49.34±1.26a 40.342 0.000桃紅四物湯低劑量組5 1.35 38.13±1.17ab 40.36±1.23ab 42.63±0.89ab 45.16±1.15ab 33.138 0.000桃紅四物湯高劑量組5 2.70 36.83±1.31abcd 38.61±1.72abcd 40.32±0.93abcd 42.73±1.84abcd 10.158 0.000阻滯劑組 5 8.70×10-5 37.32±1.07ab 39.26±1.22ab 40.87±1.36ab 43.18±1.27ab 22.461 0.000 F 84.295 108.692 148.226 239.257 P 0.000 0.000 0.000 0.000

圖4 Wnt5a mRNA的交互效應(yīng)輪廓圖

圖5 各組Wnt5a/GAPDH的擴(kuò)增與溶解曲線圖

2.5 各組大鼠腓腸肌Wnt5a蛋白表達(dá)比較 模型組大鼠腓腸肌Wnt5a蛋白表達(dá)明顯高于正常組（P＜0.05）；阻滯劑組、桃紅四物湯低劑量組、桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌Wnt5a蛋白表達(dá)明顯低于模型組（P＜0.05）；桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌Wnt5a蛋白表達(dá)明顯低于桃紅四物湯低劑量組（P＜0.05）；桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌Wnt5a蛋白表達(dá)與阻滯劑組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖6、表5）

圖6 各組大鼠腓腸肌Wnt5a蛋白表達(dá)（IHC，×200）

表5 各組大鼠腓腸肌Wnt5a蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 各組大鼠腓腸肌Wnt5a蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與桃紅四物湯低劑量組比較，cP＜0.05；與阻滯劑組比較，dP＞0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 給藥劑量[g/(kg·d)]Wnt5a表達(dá)積分光密度值（IA值）正常組 5 - 9.10±0.94模型組 5 - 28.36±2.65a桃紅四物湯低劑量組5 1.35 17.82±1.38ab桃紅四物湯高劑量組5 2.70 13.45±1.75abcd阻滯劑組 5 8.70×10-5 12.55±2.05ab F 96.337 P 0.000

3 討 論

LIRI的機(jī)理極為復(fù)雜，就目前的研究成果看，肢體缺血-再灌注損傷的病理機(jī)制是能量代謝障礙、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)毒效應(yīng)、鈣超載等導(dǎo)致組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能障礙，以及引發(fā)大量自由基和一些促炎性細(xì)胞因子爆發(fā)釋放，如NF-κB、IL-1β、TNF-α等，從而引起全身炎癥反應(yīng)[4]。中醫(yī)學(xué)中雖無“LIRI”病名的記載，但根據(jù)其病變的臨床表現(xiàn)（主要為腫脹、疼痛、組織壞死等），以及目前對骨筋膜室綜合征、斷肢再植術(shù)后、動(dòng)脈栓塞等肢體缺血-再灌注損傷疾病的中醫(yī)病因病機(jī)分析和認(rèn)知，LIRI當(dāng)屬于“股腫”“脈痹”等范疇，病機(jī)多集中在瘀血內(nèi)阻，氣血運(yùn)行不暢等方面，證屬“氣滯血瘀”，而治則以“通行血脈”“化瘀消腫”為法。桃紅四物湯為活血化瘀的代表方，方中桃仁、紅花活血化瘀；熟地黃、當(dāng)歸甘溫，滋補(bǔ)肝腎之陰，養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，通達(dá)氣機(jī)；川芎行氣活血，調(diào)暢氣血，以助活血之功，使氣行以達(dá)血行[11]。全方以活血化瘀為主，配合滋補(bǔ)肝腎，條達(dá)氣機(jī)，行氣活血，消腫止痛，使瘀血祛，新血生，共奏氣通、血活、腫消、痛減之功效。因而，桃紅四物湯廣泛應(yīng)用于缺血-再灌注損傷疾病的防治，如桃紅四物湯能夠抑制腦缺血-再灌注損傷后大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元Caspase-3與p53的表達(dá)，從而減輕腦細(xì)胞的凋亡[12]；也有學(xué)者[13]從基因傳導(dǎo)通路方面證實(shí)桃紅四物湯對大鼠腦缺血-再灌注損傷具有保護(hù)作用。在腎臟缺血-再灌注損傷方面，桃紅四物湯可通過抗氧化作用改善缺血-再灌注大鼠腎臟功能[14]；在肢體缺血-再灌注損傷疾病方面，有研究顯示桃紅四物湯加減可改善四肢骨折術(shù)后患者血清炎癥因子水平，減輕四肢骨折肢體腫脹程度，可有效預(yù)防骨筋膜室綜合征形成[7]；有學(xué)者使用桃紅四物湯干預(yù)家兔早期骨筋膜室綜合征模型，發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯能上調(diào)早期骨筋膜室綜合征模型家兔血清SOD含量，抑制氧自由基的過度生成，降低血中CK、LDH、AST含量,從而改善骨骼肌細(xì)胞損傷，防止骨筋膜室綜合征這一惡性循環(huán)進(jìn)行性加重[15]。本課題組從2009年開始觀察桃紅四物湯治療肢體缺血性疾病的療效，療效頗佳，并根據(jù)處方中各藥物所含有效成分的理化性質(zhì)，采用水提、減壓及濃縮制成中成藥桃紅四物湯，便于保存，使用更為方便，在我院廣泛運(yùn)用，取得了很好的效果。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示其可以提高肢體缺血-再灌注損傷大鼠血清SOD的濃度，降低MDA濃度，減少氧自由基產(chǎn)生，減輕過氧化反應(yīng)從而減輕肢體缺血-再灌注損傷[16]。但目前桃紅四物湯對LIRI骨骼肌保護(hù)作用的分子機(jī)制尚不明確。

隨著醫(yī)學(xué)研究的深入，近年來國內(nèi)外學(xué)者對LIRI的病理機(jī)制研究及防治重心逐漸深入至分子機(jī)制水平和信號因子靶向調(diào)控方面[5]。Wnt信號通路是一條繁雜的信號網(wǎng)絡(luò)，在機(jī)體生長、發(fā)育、代謝、免疫、應(yīng)激等多種生理過程中發(fā)揮著重要作用，Wnt5a是Wnt家族中具有代表性的Wnt蛋白，主要來源于巨噬細(xì)胞的效應(yīng)分子，通過自分泌和旁分泌發(fā)揮作用，近年來廣泛受到關(guān)注，其既能作用于經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路，又能活化非經(jīng)典的Wnt/Ca2+通路。其中Wnt5a/Ca2+信號通路的異常參與了許多疾病如腫瘤、炎癥、代謝性等疾病發(fā)生和發(fā)展[17]，Wnt5a可介導(dǎo)不同的受體參與調(diào)節(jié)不同的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并最終導(dǎo)致不同的結(jié)果，最常見的受體為卷曲蛋白（Frizzled受體，F(xiàn)z）受體，當(dāng)Wnt5a信號與胞膜上Fz受體結(jié)合時(shí)，將膜磷脂（PIP2）水解，生成第二信使IP3和二?；视停―G），由此激活Wnt/Ca2+信號通路，一方面通過IP3-Ca2+信號通路促進(jìn)Ca2+大量釋放，DG-PKC通路抑制Ca2+吸收從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度持續(xù)升高，形成惡性循環(huán)導(dǎo)致鈣超載，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]；另一方面通過Wnt5a/Fz5-IP3R-CaMKⅡ信號途徑和Wt5a/Fz5-DG-PKC-MAPK途徑，誘導(dǎo)分泌IL-6、IL-8、MIP-1β、TNF-α等炎癥因子釋放，其中TNF-α既能促進(jìn)NF-κB表達(dá)，又依賴NF-κB反作用于巨噬細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞自分泌Wnt5a，由此Wnt5a/Ca2+通路與炎癥信號途徑組成了繁雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，二者聯(lián)系密切又交互影響，Wnt5a/Ca2+通路的失衡會導(dǎo)致炎癥應(yīng)答的紊亂，從而誘發(fā)一系列炎癥反應(yīng)[19]。

課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，桃紅四物湯適宜劑量[1.35、2.70 g/（kg·d）]對預(yù)處理大鼠LIRI骨骼肌具有保護(hù)作用，并且呈量效關(guān)系，而過高桃紅四物湯劑量[5.4 g/（kg·d）]不僅未出現(xiàn)理想的量效關(guān)系，反而加重骨骼肌損傷[8]。因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以1.35、2.70 g/（kg·d）劑量為桃紅四物湯低、高劑量。本研究HE染色顯示模型組可見肌纖維紊亂、腫脹，大部分肌纖維完整性、連續(xù)性遭到破壞，細(xì)胞核散在稀疏，肌纖維間明顯炎性浸潤，提示造模成功。研究顯示阻滯劑組，桃紅四物湯低、高劑量組大鼠腓腸肌中IL-1β、TNF-α含量明顯低于模型組，說明阻滯劑、桃紅四物湯預(yù)處理可抑制炎癥反應(yīng)從而達(dá)到減輕LIRI作用。RT-qPCR和IHC結(jié)果顯示，與正常組比較，LIRI各組中Wnt5a蛋白及其mRNA表達(dá)均一致性上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。鑒于Wnt5a在Wnt信號通路中信號分子屬性[17]，以及Wnt5a與炎癥信號在炎癥性疾病中的交叉互動(dòng)作用[19]，這提示W(wǎng)nt5a可能是LIRI中的關(guān)鍵蛋白，LIRI中骨骼肌Wnt5a表達(dá)上調(diào)，可激活Wnt信號通路從而介導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。與模型組比較，阻滯劑組，桃紅四物湯低、高劑量組中Wnt5a蛋白及其mRNA表達(dá)一致性下調(diào)，而桃紅四物湯低、高劑量組，阻滯劑組中Wnt5a蛋白及其mRNA表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明LIRI經(jīng)桃紅四物湯預(yù)處理后，Wnt5a的表達(dá)下調(diào)，起到類似Wnt5a阻滯劑效應(yīng)，在一定程度上抑制因LIRI所激活的Wnt5a信號通路，通過抑制炎癥反應(yīng)、減少細(xì)胞凋亡從而達(dá)到減輕LIRI作用，這和本課題體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致[9]。本研究表明，時(shí)間因素和組別因素對IL-1β、TNF-α以及Wnt5a mRNA表達(dá)的影響存在交互效應(yīng)，提示在肢體缺血-再灌注損傷早期，骨骼肌損傷的病理變化進(jìn)行性進(jìn)展，早期及時(shí)應(yīng)用有效藥物濃度干預(yù)有利于減輕這一病理過程，這為LIRI骨骼肌細(xì)胞損傷的分子機(jī)制和桃紅四物湯的防治作用提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

本研究中桃紅四物湯低、高劑量組IL-1β、TNF-α炎癥因子水平下降高于同一時(shí)間點(diǎn)阻滯劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。我們推測這可能與引起LIRI的復(fù)雜的分子病理機(jī)制有關(guān)，鑒于Wnt5a是眾多Wnt家族中的一員，以及中藥多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點(diǎn)效應(yīng)，桃紅四物湯在抑制LIRI炎癥反應(yīng)方面可能存在多途徑、多靶點(diǎn)效應(yīng)，這值得我們進(jìn)一步深入研究。