李偉藝，劉紅松，高山瑛，蘇志強(qiáng)

（漢中市人民醫(yī)院，陜西 漢中 723000）

腦中風(fēng)是由腦部血液循環(huán)障礙導(dǎo)致局部神經(jīng)功能缺失為主要特征的疾病，具有致殘率高、致死率高和患病率高的特點[1]。隨著國家經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民生活水平顯著提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大變化，致使糖尿病、高血壓、冠心病等人群增加，從而使中風(fēng)發(fā)病率大幅增加[2]。銀杏內(nèi)酯注射液主要成分為白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B和銀杏內(nèi)酯C等，有活血化瘀，通經(jīng)活絡(luò)的功能，主要用于急性期和恢復(fù)期腦卒中[3]。近年來，臨床研究發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯對急性腦梗死及動脈粥樣硬化腦梗死患者神經(jīng)功能均有改善的作用，但其對神經(jīng)元自噬的影響研究尚少[4]。本研究通過建立腦中風(fēng)大鼠模型，觀察銀杏內(nèi)酯注射液對腦中風(fēng)大鼠恢復(fù)期的改善作用，并探究其對神經(jīng)元自噬的影響，以期為臨床治療腦中風(fēng)提供新的方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SD雄性大鼠100只，體質(zhì)量180～200 g，8周齡，清潔級，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0003。所有大鼠實驗前于室溫23～25℃，濕度60%～65%，人工12 h晝/夜循環(huán)照明，常規(guī)飼養(yǎng)。實驗操作均通過醫(yī)院倫理委員會審查。

1.1.2 主要試劑與儀器 銀杏內(nèi)酯注射液（成都百裕制藥股份有限公司，批號：08150802，規(guī)格：每盒5支，每支2 mL，含萜類內(nèi)酯10 mg），奧拉西坦注射液（哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司，批號：160518B，規(guī)格：每盒6支，每支5mL：1.0g），鼠抗神經(jīng)元特異性核蛋白（neuronal nuclei，NeuN）單克隆抗體（美國Chemicon公司），免疫熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），兔抗大鼠Beclin-1、P62、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（Microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）單克隆抗體（美國Chemicon公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（美國Thermo Fisher公司），TYU-20C正置型熒光顯微鏡（上海豫光儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組100只大鼠隨機(jī)取80只，采用大腦中動脈栓塞法[5]建立腦中風(fēng)大鼠模型：術(shù)前大鼠禁食不禁水12 h，用3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉，仰臥固定后，左側(cè)頸部備皮正中切口，分離左側(cè)頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈。夾閉頸內(nèi)動脈及頸總動脈，結(jié)扎頸外動脈近心端，在頸外動脈上切一小口自頸內(nèi)動脈向顱內(nèi)插入線栓，深度18～20 mm出現(xiàn)阻力時停止插入，固定線栓，結(jié)扎切口，松開頸總動脈，逐層縫合皮膚。大鼠清醒后，采用Longa評分法[6]對其進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，評分2～3分為造模成功。評分標(biāo)準(zhǔn)：無神經(jīng)功能缺損為0分；輕度神經(jīng)功能缺損（右前肢無法完全伸展）為1分；中度神經(jīng)功能缺損（行走時向右側(cè)旋轉(zhuǎn)）為2分；重度神經(jīng)功能缺損（行走時向右側(cè)傾斜）為3分；不能自發(fā)行走，有意識障礙為4分。將造模成功的73只大鼠隨機(jī)分為模型組18只、低劑量組18只、高劑量組18只、陽性對照組19只，其余20只為假手術(shù)組，手術(shù)方法同上，但不插線栓。

1.2.2 干預(yù)方法 造模2 h后進(jìn)行干預(yù)，銀杏內(nèi)酯注射液和奧拉西坦注射液使用前在250 mL無菌生理鹽水中稀釋，低劑量組腹腔注射1.25 mg/kg銀杏內(nèi)酯注射液，高劑量組腹腔注射2.5 mg/kg銀杏內(nèi)酯注射液，陽性對照組腹腔注射50 mg/kg奧拉西坦注射液，假手術(shù)組和模型組腹腔注射無菌生理鹽水，共干預(yù)14 d。

1.2.3 神經(jīng)功能評估 各組大鼠干預(yù)結(jié)束2 d后進(jìn)行神經(jīng)功能評估，評分方法同“1.2.1”。

1.2.4 爬桿實驗進(jìn)行運(yùn)動功能評估 神經(jīng)功能評估結(jié)束后進(jìn)行爬桿實驗，正式測試前2 d，進(jìn)行預(yù)實驗，3次/d。將大鼠放在光滑金屬管頂部，頭向下，使其爬向管底。整個過程用攝像機(jī)記錄，全部拍攝完，回放錄像，按照評分標(biāo)準(zhǔn)計分，每只大鼠爬桿2次，最終計算平均分。爬桿實驗評分標(biāo)準(zhǔn)：四肢并用，一次順利從桿上爬下為0分；一步一步螺旋向下爬行但兼有后肢滑行行為為0.5分；上桿后間歇停頓數(shù)次后爬下，但可抱緊金屬桿為1分；滑行后掉落為1.5分；不能抓桿，直接掉落為2分。

1.2.5 腦梗死體積評估 爬桿實驗結(jié)束后，各組隨機(jī)處死4只大鼠，斷頭取腦，取出小腦和嗅球，用濾紙擦干表面血跡，置于-20℃冰箱10 min后取出，連續(xù)切6個冠狀切片，厚度約2 mm，將切片浸入1% TTC染色液中，37℃恒溫避光孵育15 min，使腦片均勻著色。經(jīng)TTC染色后，正常腦組織顯示紅色，梗死區(qū)域顯示白色，每一腦片梗死面積乘以2 mm厚度得到一片腦片梗死體積，再將各腦片數(shù)值相加后得到梗死總體積，梗死體積百分比=（梗死總體積/腦部總體積）×100%。

1.2.6 NeuN免疫熒光法檢測大腦皮層神經(jīng)元缺失情況 各組隨機(jī)處死5只大鼠，取出大腦，在10%甲醛溶液浸泡12 h后，20%和30%蔗糖梯度脫水，直至大腦沉底，放4℃保存?zhèn)溆?。取?℃保存的大腦，在大腦皮質(zhì)頂葉區(qū)域進(jìn)行冠狀切片，切片厚度25 μm，將腦切片均勻鋪在載玻片上后，-20℃保存?zhèn)溆?。對腦切片進(jìn)行免疫熒光實驗，滴加山羊血清封閉液孵育10 min，加入鼠抗NeuN單克隆抗體（1∶1 000）于4℃孵育過夜，0.01 mmol/L PBS沖洗3次，5 min/次，加入羊抗鼠IgG抗體（1∶4000），室溫避光孵育1h，0.01mmol/L PBS沖洗3次，5 min/次，中性樹膠封片，熒光顯微鏡觀察。每張切片選取4個視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對NeuN陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.2.7 TUNEL染色觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡 剩余大鼠全部處死，取腦，分離大腦皮層（各4只）進(jìn)行切片脫蠟，其余大鼠大腦皮層-80℃保存。0.3% H2O2浸泡5 min，PBS清洗2次，5 min/次；蛋白酶K 37℃，30 min，PBS清洗3次，5 min/次；TUNEL反應(yīng)液37℃，60 min，PBS清洗3次，5 min/次；3% BSA，20 min，PBS清洗3次，5 min/次；POD轉(zhuǎn)換液37℃濕盒，30 min，PBS清洗5 min；DAB顯色5 min，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片，置于顯微鏡下觀察大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。每張切片選取4個視野，計算凋亡率，凋亡率=（凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.2.8 Western Blotting檢測大腦皮層Beclin-1、P62和LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)水平 取出-80℃保存的大腦皮層，置于液氮中，加入蛋白提取裂解液，冰上裂解，離心取上清用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，95℃水浴使蛋白變性，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗膜后分別加入1∶1 000稀釋的Beclin-1、P62、LC3單克隆抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜后加入1∶4 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，TBST洗膜后加入ECL發(fā)光液顯影，采用ImageJ軟件分析圖像，以β-actin為內(nèi)參，Beclin-1、P62和LC3-Ⅱ蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值表示蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 模型組、低劑量組、高劑量組、陽性對照組大鼠神經(jīng)功能缺損評分分別為（2.96±0.29）分、（1.77±0.21）分、（1.52±0.17）分、（1.31±0.16）分，神經(jīng)功能缺損評分組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=56.534，P＜0.001）。與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠神經(jīng)功能缺損評分下降（t=14.101，18.174，21.584，P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組和陽性對照組大鼠神經(jīng)功能缺損評分下降（t=3.926，7.520，P＜0.05）；與高劑量組比較，陽性對照組大鼠神經(jīng)功能缺損評分下降（t=3.871，P＜0.05）。

2.2 各組大鼠運(yùn)動功能評分比較 模型組、低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠運(yùn)動功能評分分別為（1.56±0.17）分、（1.23±0.13）分、（0.84±0.09）分、（0.51±0.06）分，運(yùn)動功能評分組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=45.451，P＜0.001）。與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠運(yùn)動功能評分下降（t=6.542，15.881，25.326，P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組和陽性對照組大鼠運(yùn)動功能評分下降（t=10.465，21.825，P＜0.05）；與高劑量組比較，陽性對照組大鼠運(yùn)動功能評分下降（t=13.190，P＜0.05）。

2.3 各組大鼠腦梗死體積百分比比較 模型組、低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠腦梗死體積百分比分別為（28.73±2.92）%、（21.13±2.23）%、（16.14±1.65）%、（10.94±1.12）%，腦梗死體積百分比組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=87.845，P＜0.001）。與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠腦梗死體積百分比下降（t=4.137，7.508，11.377，P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組和陽性對照組大鼠腦梗死體積百分比下降（t=3.598，8.167，P＜0.05）；與高劑量組比較，陽性對照組大鼠腦梗死體積百分比下降（t=5.215，P＜0.05）。（見圖1）

圖1 各組大鼠腦梗死體積

2.4 各組大鼠NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量比較NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組、低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量增多（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組和陽性對照組大鼠NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量增多（P＜0.05）；與高劑量組比較，陽性對照組大鼠NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量增多（P＜0.05）。（見表1、圖2）

圖2 各組大鼠NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量比較（×400）

表1 各組大鼠NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量（±s）

表1 各組大鼠NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05；與高劑量組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量(個)假手術(shù)組 5 - 274.57±19.54模型組 5 - 61.73±7.56a低劑量組 5 1.25 87.72±9.43ab高劑量組 5 2.50 128.86±13.58abc陽性對照組 5 50.00 198.76±20.23abcd F 25.768 P＜0.001

2.5 各組大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 神經(jīng)細(xì)胞凋亡率組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組，低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組和陽性對照組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與高劑量組比較，陽性對照組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）。（見表2、圖3）

圖3 各組大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況（×400）

表2 各組大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況（±s）

表2 各組大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05；與高劑量組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率(%)假手術(shù)組 4 - 1.46±0.21模型組 4 - 78.45±8.31a低劑量組 4 1.25 43.62±5.38ab高劑量組 4 2.50 24.36±3.24abc陽性對照組 4 50.00 11.53±2.58abcd F 142.632 P＜0.001

2.6 各組大鼠大腦皮層Beclin-1、P62和LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)水平比較 大腦皮層Beclin-1、P62和LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)水平組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組、低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠大腦皮層Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)水平升高，P62蛋白相對表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠大腦皮層Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)水平降低，P62蛋白相對表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組和陽性對照組大鼠大腦皮層Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)水平降低，P62蛋白相對表達(dá)水平升高（P＜0.05）；陽性對照組和高劑量組大鼠大腦皮層Beclin-1、P62和LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表3、圖4）

表3 各組大鼠大腦皮層Beclin-1、P62和LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)水平（±s）

表3 各組大鼠大腦皮層Beclin-1、P62和LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)水平（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05

組別 動物數(shù)只 給藥劑量()(mg/kg)Beclin-1 P62 LC3-Ⅱ假手術(shù)組 5 -模型組 5 -低劑量組 5 1.25高劑量組 5 2.50陽性對照組5 50.00 F 25.744 20.346 18.736 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.43±0.05 1.46±0.16a 1.20±0.13ab 0.99±0.11abc 0.97±0.09abc 1.01±0.13 0.21±0.02a 0.49±0.05ab 0.75±0.08abc 0.78±0.08abc 0.81±0.09 1.47±0.15a 1.25±0.13ab 0.97±0.10abc 0.99±0.11abc

圖4 各組Beclin-1、P62和LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)水平

3 討 論

腦中風(fēng)是一種突發(fā)性腦血管疾病，發(fā)病時，腦動脈阻塞，導(dǎo)致大腦局部供血不足，從而使該區(qū)域腦組織受損，引起神經(jīng)功能障礙[7-8]。目前，由于各種條件限制，多數(shù)患者不能在中風(fēng)后關(guān)鍵3 h內(nèi)接受治療，而是在急性期進(jìn)行非手術(shù)治療，在損傷后期依靠神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)修復(fù)。因此，找到理想的恢復(fù)期治療藥物成為腦中風(fēng)研究的關(guān)鍵。銀杏是一種具有藥用價值的植物。研究表明，銀杏內(nèi)酯注射液及其有效組分可以改善大腦中動脈阻塞模型大鼠急性缺血性腦損傷[9]。奧拉西坦是新型吡咯烷酮類藥物，可以促進(jìn)腦代謝，提高大腦對葡萄糖、氧的利用能力，從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞功能恢復(fù)，改善機(jī)體和精神行為有關(guān)的腦整合機(jī)制，在腦中風(fēng)的治療中已較為成熟[10]。因此，本研究以奧拉西坦為陽性對照，給予腦中風(fēng)模型大鼠銀杏內(nèi)酯注射液，觀察銀杏內(nèi)酯注射液對腦中風(fēng)大鼠恢復(fù)期的改善作用，旨在為中風(fēng)恢復(fù)期治療提供新的思路。

銀杏內(nèi)酯注射液主要成分為白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B和銀杏內(nèi)酯C等，白果內(nèi)酯能維持血管內(nèi)皮完整性，促進(jìn)血管內(nèi)皮增生；銀杏內(nèi)酯A可緩解焦慮、改善心肌缺血、恢復(fù)膽堿能損傷記憶功能；銀杏內(nèi)酯B是血小板活化因子拮抗劑，具有抗氧化、延緩衰老、保護(hù)受損傷神經(jīng)元的功能；銀杏內(nèi)酯C可以輔助治療心、腦血管疾病[11]。研究表明，銀杏內(nèi)酯可以通過降低血腦屏障滲透性、改善腦代謝紊亂、促進(jìn)良性自噬、抑制神經(jīng)元凋亡等方面發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[12]。張佳潔等[13]研究發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯注射液治療急性腦梗死有利于改善血液流變學(xué)指標(biāo)、有效調(diào)節(jié)血清血管內(nèi)皮生長因子、血管生成素-Ⅱ和膠質(zhì)纖維酸性蛋白含量，改善神經(jīng)功能，效果顯著。吳勇等[14]研究發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯注射液輔助治療老年缺血性腦卒中能有效減輕患者神經(jīng)功能缺損程度，提高患者生活能力。本研究中銀杏內(nèi)酯注射液治療腦中風(fēng)大鼠后，大鼠神經(jīng)功能缺損評分、運(yùn)動功能評分、腦梗死體積百分比和神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯降低，NeuN陽性細(xì)胞增多，對腦中風(fēng)大鼠恢復(fù)期的改善作用明顯。

自噬是真核細(xì)胞中廣泛存在的溶酶體依賴降解途徑，是細(xì)胞自我保護(hù)的重要機(jī)制，在維持細(xì)胞存活、更新、胞內(nèi)組分再利用和內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用[15-16]。Beclin-1是哺乳動物細(xì)胞酵母自噬相關(guān)基因Atg6的同源基因，其上調(diào)提示自噬被激活；LC3是Atg8的同源基因，LC3-Ⅱ表達(dá)水平及LC3-Ⅱ／Ⅰ比值大小可反映自噬水平的高低；P62是特異性自噬途徑降解蛋白，其表達(dá)水平與自噬激活程度成反比[17-18]。本研究中模型組Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，P62蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明腦中風(fēng)后神經(jīng)元自噬被過度激活。潘思敏等[19]研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中再灌注后神經(jīng)細(xì)胞損傷嚴(yán)重，藥物治療后自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ下調(diào)，提示缺血性腦卒中再灌注的神經(jīng)細(xì)胞損傷與過度自噬有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯注射液能抑制大腦中動脈阻塞大鼠缺血復(fù)灌后LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，以及自噬底物P62水平降低，阻止自噬水平過度升高，提示銀杏內(nèi)酯注射液具有治療缺血性腦卒中急性期神經(jīng)損傷的作用，是通過抑制缺血再灌后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和過度自噬發(fā)揮作用的[20]。本研究得到類似結(jié)果，腹腔注射銀杏內(nèi)酯注射液后，低劑量組與高劑量組Beclin-1和LC3-Ⅱ下調(diào)，P62上調(diào)，提示銀杏內(nèi)酯注射液可能通過抑制神經(jīng)元過度自噬從而發(fā)揮對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

綜上所述，銀杏內(nèi)酯注射液對大鼠腦中風(fēng)恢復(fù)期具有改善作用，而且可能通過抑制神經(jīng)元過度自噬發(fā)揮對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，為臨床治療提供了一定的理論依據(jù)。