馬 媛，楊 洋，陳書(shū)強(qiáng)，王曉紅

(1.中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，西安 710038;2.西安市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，西安 710004)

輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)是指以治療不孕不育癥為目的而采取的一切在體外操作配子及胚胎的治療手段或方法，主要包括體外受精、胚胎體外培養(yǎng)、胚胎冷凍解凍技術(shù)等。但是，由于體外環(huán)境和體內(nèi)的生理環(huán)境具有極大的不同，目前體外條件仍無(wú)法完全模擬體內(nèi)環(huán)境。與此同時(shí)，胚胎早期其本身尚不具備屏障和保護(hù)功能。因此，體外培養(yǎng)環(huán)境會(huì)給配子及胚胎造成環(huán)境應(yīng)激，影響胚胎的發(fā)育潛能。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[1]，胚胎體外培養(yǎng)可影響小鼠胚胎的發(fā)育，降低囊胚形成率及著床率，影響后期胎鼠的宮內(nèi)生長(zhǎng)。但是，胚胎發(fā)育及存活率下降的相關(guān)機(jī)制尚不明確。在生命活動(dòng)進(jìn)行時(shí)，維持基因組穩(wěn)定性需要DNA精確的復(fù)制和遺傳。DNA的完整性是保障胚胎發(fā)育、胚胎種植甚至子代健康的基礎(chǔ)[2]。如果DNA遭受到內(nèi)源性或外源性刺激，可引起DNA損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯及DNA損傷修復(fù)等。其中，DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand break,DSB)[3]對(duì)基因組完整性及后續(xù)的細(xì)胞存活具有嚴(yán)重的影響。既往研究顯示[4-6]，ART中多個(gè)步驟會(huì)導(dǎo)致DNA損傷，進(jìn)一步影響配子的質(zhì)量、胚胎發(fā)育甚至胎兒發(fā)育。本研究以DNA損傷為出發(fā)點(diǎn)，研究體外培養(yǎng)環(huán)境對(duì)小鼠胚胎DSBs的影響，為體外培養(yǎng)技術(shù)影響胚胎發(fā)育的潛在機(jī)制研究提供思路與方向。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級(jí)ICR小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。雌鼠4～6周齡，雄鼠3～6月齡。主要試劑和儀器：胚胎培養(yǎng)采用KSOM(Millipore,美國(guó))，微量胚胎cDNA線性擴(kuò)增使用德國(guó)Qiagen的試劑盒REPLI-g WTA single Cell Kit,熒光聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒均購(gòu)自Takara公司(日本)，一抗γH2AX抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司(兔單克隆抗體，Anti-gamma H2AX，ab81299)，二抗購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司(驢抗兔，A21206)，Hoechst購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(Hoechst 33258 solution)。實(shí)體解剖鏡(Motic,中國(guó))，CO2培養(yǎng)箱(Thermo,美國(guó))，培養(yǎng)皿(35mm)(Nunc,丹麥)，超凈臺(tái)(Labconco,美國(guó))，熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國(guó)),激光共聚焦顯微鏡(Olympus,日本)。

1.2 研究方法

1.2.1 小鼠模型建立及胚胎收集 自然交配組(natural conception，NC)組:選取發(fā)情雌鼠，與雄鼠自然合籠，次日檢查陰栓。見(jiàn)栓即為交配成功，當(dāng)日計(jì)為0.5天。于2.5天處死孕鼠取雙側(cè)輸卵管，PBS沖洗獲得8細(xì)胞期胚胎。體外培養(yǎng)組(in vitro culture，IVC)組：選取發(fā)情雌鼠，與雄鼠自然合籠，次日檢查陰栓。見(jiàn)栓當(dāng)日處死雌鼠，于輸卵管取受精卵，用0.3%透明質(zhì)酸酶消化受精卵周圍顆粒細(xì)胞，將消化分離的受精卵多次沖洗，轉(zhuǎn)入KSOM溶液中培養(yǎng)，于培養(yǎng)的2.5天收集8細(xì)胞期胚胎。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) (1)微量胚胎cDNA線性擴(kuò)增：使用德國(guó)Qiagen的試劑盒REPLI-g WTA single Cell Kit，選擇每組8細(xì)胞期胚胎20枚，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。(2)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)：根據(jù)TaKaRa實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說(shuō)明配制反應(yīng)體系，反應(yīng)總體系為20μl:SYBR Green 10μl，PCR特異上、下游引物按1：1混合后取1.5μl,cDNA模板1.5μl,滅菌蒸餾水7μl。擴(kuò)增條件：95℃ 3min;95℃ 15s,60℃ 30s,72℃ 30s,35個(gè)cycle;72℃ 2min。以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物序列來(lái)自Primerbank。每次檢測(cè)設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)樣本重復(fù)3次。以上在每個(gè)PCR循環(huán)的延伸期采集熒光信號(hào)，PCR反應(yīng)完成后利用溫度梯度變性獲得溶解曲線供PCR產(chǎn)物定性分析。根據(jù)PCR擴(kuò)增曲線，得到每個(gè)樣本的循環(huán)周期數(shù)(Cq值)，2-△△Ct法計(jì)算各組目的基因表達(dá)。胚胎發(fā)育潛能相關(guān)基因引物序列及DNA損傷相關(guān)因子引物序列，見(jiàn)表1、2。

表1 胚胎發(fā)育潛能相關(guān)基因引物序列

表2 DNA損傷相關(guān)因子引物序列

1.2.3 胚胎免疫熒光檢測(cè)及分析 (1)胚胎免疫熒光操作。收集兩組8細(xì)胞期胚胎，以下每個(gè)操作步驟之間均需用含0.1%PVA的PBS洗滌8細(xì)胞期胚胎3次。4%多聚甲醛室溫固定2h，轉(zhuǎn)入0.2%Triton-X打孔30min,封閉液室溫封閉2h，轉(zhuǎn)入一抗4℃孵育過(guò)夜，γH2AX一抗為兔源，濃度為1：2000。次日，兩組8細(xì)胞期胚胎轉(zhuǎn)入488標(biāo)記的抗兔熒光二抗，二抗?jié)舛?：500，避光孵育2h。用含10μg/mL Hoechst的PBS室溫避光染核30min，PBS洗滌干凈，封片，熒光顯微鏡照相。(2)胚胎免疫熒光分析。熒光亮度采用軟件Image J進(jìn)行分析，選取目標(biāo)區(qū)域，分析該區(qū)域平均光密度水平，同樣計(jì)算出同一樣本Hoechst染核的平均光密度。γH2AX平均光密度值與核平均光密度值比值即為本樣品的實(shí)際平均光密度值。

2 結(jié) 果

2.1 胚胎體外培養(yǎng)對(duì)8細(xì)胞期胚胎早期發(fā)育的影響 與NC組相比，IVC組的Lif表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組8細(xì)胞期胚胎發(fā)育潛能比較

2.2 體外培養(yǎng)對(duì)8細(xì)胞期胚胎DNA損傷的影響研究 與NC組相比，IVC組γH2AX相對(duì)熒光密度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.537±0.133 vs 0.419±0.095,P<0.05),見(jiàn)圖1。

2.3 體外培養(yǎng)對(duì)胚胎DNA損傷相關(guān)基因表達(dá)的影響研究 與NC組相比，IVC組的DNA損傷相關(guān)基因Casp3(NC 0.985±0.033 vs IVC 1.641±0.319)和Fas(NC 0.897±0.121 vs IVC 0.994±0.147)表達(dá)顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 體外培養(yǎng)對(duì)8細(xì)胞期胚胎DNA損傷相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖1 體外培養(yǎng)對(duì)8細(xì)胞期胚胎γH2AX的影響

3 討 論

在胚胎早期，一些影響胚胎早期分化及發(fā)育的標(biāo)志性分子的改變，可導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常，決定胚胎的命運(yùn)。研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)環(huán)境可影響小鼠胚胎的多個(gè)命運(yùn)決定因子。這些因子中，Pou5f1、Nanog是多潛能因子，可促進(jìn)小鼠胚胎中細(xì)胞的多項(xiàng)分化功能[7]。而Lif可支持卵裂期細(xì)胞向囊胚發(fā)育，并促進(jìn)胚胎著床能力[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，IVC組的Lif表達(dá)明顯下調(diào)。既往研究表明，體外培養(yǎng)的山羊及貓的胚胎也出現(xiàn)了早期胚胎命運(yùn)決定相關(guān)因子的變化[9-10]，與本研究結(jié)果一致。提示單純體外培養(yǎng)環(huán)境即可影響小鼠胚胎的早期命運(yùn)。

DNA的精確復(fù)制和遺傳對(duì)維持基因組穩(wěn)定性有重要作用。如早期胚胎在DNA復(fù)制和遺傳過(guò)程中發(fā)生損傷，可能影響胚胎及子代發(fā)育。既往有研究提示，ART技術(shù)可導(dǎo)致DNA損傷[2,4,6]。與輔助生殖技術(shù)相關(guān)的DNA損傷是影響配子和胚胎發(fā)育的重要因素[11]。體外培養(yǎng)技術(shù)是ART中重要的組成部分，故本研究進(jìn)一步對(duì)經(jīng)體外培養(yǎng)的小鼠胚胎DNA損傷及相關(guān)損傷修復(fù)因子的表達(dá)進(jìn)行分析。

H2AX是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中核心組蛋白H2A的亞型，當(dāng)發(fā)生DSBs時(shí)，H2AX蛋白發(fā)生磷酸化形成γ-H2AX，因此，對(duì)γ-H2AX的識(shí)別成為檢測(cè)DSBs的理想手段[3]。本研究顯示，IVC組γH2AX相對(duì)熒光密度顯著升高。提示體外培養(yǎng)可導(dǎo)致胚胎中DNA雙鏈斷裂損傷的發(fā)生增加。

在DSBs過(guò)程中，一些因子可在細(xì)胞凋亡、染色質(zhì)重排、DNA修復(fù)等過(guò)程發(fā)揮作用。Gadd45a參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程[12]。Fas系統(tǒng)是死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要凋亡途徑之一，Casp3是Fas介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路中的核心蛋白，是細(xì)胞凋亡性死亡的最終執(zhí)行者[13]。Ddit3參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與的凋亡通路[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，IVC組的DNA損傷相關(guān)基因Fas和Casp3表達(dá)顯著上升。提示體外培養(yǎng)環(huán)境可在導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂損傷，并在多個(gè)方面發(fā)揮作用，可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和染色質(zhì)重排，影響小鼠早期胚胎的發(fā)育。

關(guān)于ART技術(shù)導(dǎo)致DNA損傷影響的研究中發(fā)現(xiàn)，體外受精-胚胎移植的小鼠胎兒腦組織中DNA損傷修復(fù)基因表達(dá)顯著改變[6]，玻璃化冷凍技術(shù)可導(dǎo)致小鼠卵母細(xì)胞DNA損傷加劇[4]。以上研究包括本項(xiàng)研究均提示ART技術(shù)與DNA損傷具有密切關(guān)系，關(guān)于其對(duì)后續(xù)胎鼠發(fā)育的影響仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，體外培養(yǎng)可導(dǎo)致小鼠8細(xì)胞期胚胎多潛能因子(Lif等)表達(dá)水平明顯下調(diào)，可能與小鼠胚胎DNA損傷相關(guān)基因(Casp3、Fas等)表達(dá)水平明顯上調(diào)相關(guān)，將影響小鼠胚胎發(fā)育潛能。