張春煥，闞士鋒，魏守娟，張之杰

(1.山東大學齊魯醫(yī)院檢驗科，濟南 250012；2.山東省婦幼保健院超聲科，濟南 250014)

子宮頸癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。在全世界范圍內女性腫瘤發(fā)病率和死亡率中仍排名第四[1]。晚期子宮頸癌患者的生存率并不理想,5年總生存率約60%[2]。腫瘤免疫治療可能是治療晚期宮頸癌極具希望的新方法。然而,由于腫瘤存在免疫逃逸機制,腫瘤局部通常處于免疫耐受和免疫低下狀態(tài)[3],導致免疫治療的有效性不如人意。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性桿菌外膜的主要糖脂成分,是目前研究最廣泛的腫瘤免疫治療佐劑之一。它與細胞表面的Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)結合,繼而激活免疫活性,發(fā)揮抗腫瘤效應[4-5]。研究一般認為，LPS直接作用于免疫細胞發(fā)揮促炎、抗腫瘤作用。此外，LPS也可通過調控組織局部微環(huán)境，改變局部免疫狀態(tài)。如去毒素的LPS(單磷酸脂A，MPL)作為佐劑存在于HPV預防性疫苗中，促進免疫細胞向接種局部的募集和增強免疫反應活性[6]。子宮頸癌是一種免疫敏感性腫瘤,腫瘤微環(huán)境中存在大量的免疫細胞。這提示LPS可能對子宮頸癌存在一定的治療作用。

巨噬細胞是腫瘤局部數量最多的免疫細胞群體[7-8]。作為專職的抗原提呈細胞,巨噬細胞的主要作用是識別、吞噬抗原并將其呈遞至效應T細胞,并通過分泌細胞因子等多種機制調節(jié)獲得性免疫應答活性,因此在抗腫瘤免疫中發(fā)揮關鍵作用[9]。本研究旨在探討LPS對子宮頸癌細胞分泌活性的影響,以及LPS在子宮頸癌細胞-巨噬細胞相互作用中的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人宮頸癌細胞系HeLa細胞和急性單核細胞白血病細胞系THP-1細胞均購自ATCC。

1.1.2 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清均購自Gibco公司,LPS購自Sigma公司,17細胞因子檢測試劑盒購自BioRad公司,ELISA試劑盒購自R&D公司,Trizol和脂質體2000購自Invitrogen公司。

1.1.3 主要儀器設備 CO2培養(yǎng)箱(德國Hereaus公司);超凈工作臺(蘇州安泰公司);低溫高速離心機(美國SGUVPLUS);Bio-Plex懸浮芯片檢測儀和ChemiDocTMTouch成像系統(tǒng)(美國伯樂bio-rad公司);實時定量PCR儀(羅氏LightCycler2.0)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及THP-1來源巨噬細胞的生成 細胞用添加10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。為了獲得HeLa細胞的條件培養(yǎng)基(conditioned medium,CM),將2×105個HeLa細胞接種到含2mL完全培養(yǎng)基的6孔板。6h后,加不同濃度的LPS。洗滌培養(yǎng)基,用新的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h。收集細胞上清作為HeLa條件培養(yǎng)基,用于以后實驗。1×106個THP-1細胞用100ng/mL 佛波酯(PMA)處理48h,收集貼壁細胞用于以后的實驗。在某些情況下,用PMA處理6h,用50%總體積的宮頸癌細胞CM代替培養(yǎng)液,并在PMA濃度維持在100ng/mL的情況下繼續(xù)培養(yǎng)THP-1細胞42h。

1.2.2 酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 用ELISA試劑盒檢測HeLa和THP-1來源的巨噬細胞CM中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、MCP-1、TNF-α和CCL22的濃度。

1.2.3 實時定量RT-PCR 用TRIzol提取總RNA,逆轉錄合成cDNA,進行實時定量RT-PCR檢測,采用GAPDH作為內控。用2-ΔΔCT法測定各樣本的基因表達水平。

1.2.4 小干擾RNA轉染 采用基因化學公司設計的針對人IL-6的小干擾RNA和干擾陰性對照,將5×105的HeLa細胞接種到24孔板的200μL無血清RPMI 1640培養(yǎng)基,達到60%融合。將100μL脂質體2000與IL-6 siRNA或陰性對照siRNA混合加至孔中6h。每孔再補充200μL完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48h。在某些情況下,在36h的時間點加100ng/mL的LPS,實驗繼續(xù)進行12h以上,以匹配未轉染組的培養(yǎng)時間。更換1mL完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h，收集上清。人IL-6和干擾siRNA的序列分別為5'-CUUCCAAUCUGGAUCAAU-3'和5'-GGGCAAGACGAGCGGGAAG-3'。

1.2.5 遷移分析 將1×105THP-1來源的巨噬細胞重懸于100μL的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基,加至Transwell小室上室(8μm孔,BD Biosciences)。下室加600μL含20%胎牛血清或宮頸癌細胞CM的RPMI 1640培養(yǎng)基。在5%CO2中37℃孵育24h,用甲醇固定,伊紅染色。每孔隨機拍攝5個視野,計數。

1.2.6 Western blot法檢測 6孔板細胞用PBS洗滌,等體積含1mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解緩沖液在冰上裂解,4℃ 300g離心10min,10%SDS-PAGE分離等蛋白裂解產物,轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(微孔)。在含0.1%吐溫-20的TBS中用5%牛血清白蛋白室溫封閉1h,用NF-κB或β-actin抗體4℃孵育過夜。二抗標記(1∶3000)1h,化學發(fā)光系統(tǒng)進行檢測。

2 結 果

2.1 qRT-PCR和ELISA檢測LPS作用HeLa細胞12h后上清細胞因子水平 qRT-PCR檢測結果顯示,經100ng/mL LPS處理后,IL-6 mRNA轉錄顯著上調(圖1A)。ELISA結果顯示,均檢測出IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IFN-γ、MCP-1及TNF-α表達,其中IL-6表達水平較高(約180pg/mL),未檢測出IL-1β、IL-10和IL-12表達。表明LPS作用后,IL-6表達水平均發(fā)生顯著上調,其他細胞因子表達水平未發(fā)生顯著改變(圖1B)。

2.2 LPS調節(jié)宮頸癌細胞對THP-1來源巨噬細胞

細胞因子分泌的影響 對照組HeLa細胞CM抑制THP-1來源巨噬細胞的促炎細胞因子分泌，包括IL-1β、IL-6,而IL-10和CCL22的轉錄和分泌水平均顯著上調(圖2A)。與之相比,LPS刺激后的HeLa細胞CM對THP-1來源巨噬細胞分泌譜的調節(jié)作用發(fā)生逆轉(圖2B)。

2.3 LPS促進IL-6表達而參與宮頸癌細胞對THP-1來源巨噬細胞分泌譜的調節(jié) 在THP-1向巨噬細胞誘導分化的過程中加轉染IL-6 siRNA的HeLa細胞CM，并對細胞因子的mRNA和蛋白水平進行檢測。如圖3所示,未經LPS作用時,轉染control siRNA或IL-6 siRNA的宮頸癌細胞CM對巨噬細胞的細胞因子表達均無顯著差異;而當存在LPS作用時,RT-PCR和ELISA結果分別顯示，IL-6 siRNA可顯著抑制HeLa細胞上清對巨噬細胞促炎因子的mRNA和上清中蛋白濃度，如IL-1β和IL-6,而對IL-10和CCL22的表達無顯著作用。

圖1 RT-PCR和ELISA分別檢測細胞因子轉錄和分泌水平**P<0.01 vs 對照組；★未檢測到;1:IL-1b;2:IL-2;3:IL-4;4:IL-6;5:IL-8;6:IL-10;7:IL-12;8:IFN-γ；9:MCP-1;10:TNF-α

圖2 有LPS(100ng/mL)作用的HeLa細胞條件培養(yǎng)基對THP-1來源巨噬細胞分泌譜的影響A：mRNA水平；B：蛋白水平;*P<0.05；**P<0.01CM：HeLa細胞條件培養(yǎng)基；CM-LPS：經LPS處理后的HeLa細胞條件培養(yǎng)基

圖3 有LPS(100ng/mL)作用的HeLa細胞或IL-6 siRNA轉染的HeLa細胞條件培養(yǎng)基對THP-1來源巨噬細胞分泌譜的影響A：mRNA水平；B：蛋白水平;*P<0.05；**P<0.01CM：HeLa細胞條件培養(yǎng)基；CM-LPS：經LPS處理后的HeLa細胞條件培養(yǎng)基

2.4 LPS促進宮頸癌細胞對巨噬細胞的募集作用 為探究LPS是否影響宮頸癌細胞對巨噬細胞的募集,利用Transwell小室建立體外細胞遷移模型。THP-1分化形成的巨噬細胞置于小室上層,下室為LPS作用后的宮頸癌細胞CM或對照組CM。24h后，觀察遷移至小室下層的巨噬細胞數量。如圖4A所示，經LPS作用的HeLa細胞CM顯著促進THP-1來源巨噬細胞的遷移。

進一步探究IL-6在LPS促進宮頸癌細胞對巨噬細胞募集中的作用。與對照siRNA相比,IL-6 siRNA轉染之后的HeLa細胞CM對THP-1來源巨噬細胞的募集作用被顯著抑制(圖4B)。

圖4 LPS(100ng/mL)作用的HeLa細胞或IL-6 siRNA轉染后的HeLa細胞上清對THP-1來源巨噬細胞遷移活性的影響A:LPS(100ng/mL)作用HeLa細胞上清誘導后的THP-1來源巨噬細胞遷移數;B:LPS(100ng/mL)作用HeLa細胞進行對照siRNA或IL-6 siRNA轉染，細胞上清誘導下THP-1來源巨噬細胞遷移數;**P<0.01;CM:HeLa細胞條件培養(yǎng)基;CM-LPS:經LPS處理后的HeLa細胞條件培養(yǎng)基

2.5 LPS通過NF-κB通路促進宮頸癌細胞IL-6表達 LPS開始作用5min時，HeLa細胞中磷酸化NF-κB水平即出現上調，磷酸化水平在作用30min時到達高峰，提示NF-κB信號通路被激活(圖5A)。利用NF-κB信號通路抑制劑PDTC(4μg/mL)預處理HeLa細胞1h，更換培養(yǎng)基后加LPS繼續(xù)作用12h。ELISA結果顯示，PDTC顯著逆轉LPS對IL-6分泌的促進作用(圖5B)。

圖5 NF-κB通路參與LPS對HeLa細胞IL-6分泌的促進作用A:PS處理對NF-κB通路磷酸化的影響；B:NF-κB信號通路抑制劑PDTC(4μg/mL)預處理后HeLa細胞IL-6分泌水平；**P<0.01

3 討 論

LPS可有效促進系統(tǒng)的抗腫瘤免疫活性，可作為佐劑提高治療性腫瘤疫苗的免疫原性，在腫瘤治療中具有廣闊的臨床應用前景。然而,目前關于LPS對腫瘤局部微環(huán)境的影響及其是否影響腫瘤局部浸潤的免疫細胞功能活性的問題仍所知甚少。本研究發(fā)現，LPS可通過激活NF-κB信號通路促進宮頸癌細胞分泌IL-6。細胞上清中高度表達的IL-6影響宮頸癌細胞對巨噬細胞分泌的調節(jié)作用,并促進巨噬細胞向宮頸癌細胞的募集。本研究結果提示，LPS調控宮頸癌局部微環(huán)境，并影響腫瘤細胞與腫瘤浸潤巨噬細胞之間的相互作用。

HPV感染是宮頸癌的關鍵致病因素。在目前成熟的HPV預防性疫苗中，LPS以去毒素形式(單磷酸脂A，MPL)作為佐劑存在，以提高機體的免疫活性[10]。然而，LPS對已發(fā)生的HPV感染或子宮頸癌的免疫調節(jié)作用，目前研究較少。在小鼠模型上的研究結果顯示，注射HPV16E7長肽鏈/LPS疫苗可有效促進CD8+T細胞等免疫細胞在移植瘤中的浸潤[11]。然而，由于HPV本身存在免疫抑制效應,導致感染HPV后的宮頸上皮組織局部免疫活性缺陷，表現為促炎細胞因子表達和炎性細胞浸潤數量顯著低于正常組織[12-13]。本研究結果顯示,宮頸癌細胞上清可抑制巨噬細胞M1型細胞因子如IL-1β及IL-6的表達,而促進M2型細胞因子如IL-10和CCL22的表達，從而使巨噬細胞呈現腫瘤支持性的M2型分泌譜。這與之前在腫瘤組織中觀察到的現象一致。而經LPS作用后，宮頸癌細胞上清對巨噬細胞分泌譜的調控作用被逆轉，從而提示LPS可能通過改變宮頸癌微環(huán)境，調節(jié)局部浸潤巨噬細胞的功能。

IL-6是宮頸癌中特征性的細胞因子之一,在高級別宮頸上皮內瘤變和宮頸癌組織中高表達[14-15]。由于宮頸癌細胞缺少IL-6受體的組成結構gp80[16],IL-6不能直接對腫瘤細胞產生影響，而是通過旁分泌作用影響組織中非腫瘤細胞的功能與活性[17]。本研究檢測宮頸癌細胞系HeLa細胞的細胞因子表達譜,發(fā)現存在較高水平的IL-6分泌；經LPS作用后,HeLa細胞的IL-6表達迅速發(fā)生上調；通過siRNA對宮頸癌細胞IL-6表達進行抑制,宮頸癌細胞對巨噬細胞分泌的調控及對巨噬細胞的募集作用均受到抑制。既往研究發(fā)現，宮頸癌組織中高表達的IL-6促進單核/巨噬細胞[18]在腫瘤局部的聚集。結合本研究結果，IL-6可能是聯系局部微環(huán)境炎癥反應和腫瘤侵襲的關鍵分子之一。此外，本研究結果顯示,LPS可促使宮頸癌細胞調控的巨噬細胞分泌IL-6，從而形成正反饋調節(jié)途徑。通過這一作用機制，IL-6在宮頸癌局部發(fā)揮的作用被進一步放大,包括對腫瘤細胞生物學活性的影響，以及對腫瘤局部抗腫瘤免疫活性的調節(jié)作用。

綜上所述，LPS可通過促進宮頸癌細胞IL-6的分泌,影響巨噬細胞向腫瘤的遷移和細胞因子分泌。提示LPS作為佐劑在宮頸癌治療性腫瘤疫苗中的應用應選擇適宜劑量，或采取創(chuàng)新性的呈遞方式等措施。本研究仍存在部分問題需解決,如LPS是否通過IL-6影響巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬和抗原呈遞功能?在其他類型的腫瘤中，LPS是否依然存在類似效應?后續(xù)研究中,將構建荷瘤動物模型，利用體內實驗進一步對上述問題進行探究。