張 璨

（天津生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300462）

DNA 是遺傳信息的貯存和攜帶者，是生命體重要的遺傳物質(zhì)，也是細(xì)胞和病毒的主要組成部分。DNA 上平行堆積的堿基、聚合的陰離子磷酸骨架及兩條由核苷酸鏈形成的大溝、小溝組成了藥物分子識(shí)別的位點(diǎn)[1]。研究藥物與DNA 的相互作用有助于闡明藥物的作用機(jī)制。地西他濱（Decitabin, 分子式為C8H12N4O4）是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。此藥可抑制DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶，減少DNA 的甲基化，從而可起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。有研究指出，用地西他濱治療骨髓增生異常綜合征可取得良好的效果[2]。在本文中，筆者主要是研究DNA 對(duì)地西他濱的熒光猝滅機(jī)制，并通過(guò)紫外法和黏度測(cè)定法進(jìn)一步確認(rèn)地西他濱與DNA 的結(jié)合方式。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

本研究中所用的儀器主要包括：Qubit ? Flex 熒光分光光度儀；紫外可見分光光度計(jì)（UV-1800）；pHS-s 型pH 計(jì)；烏貝路德黏度計(jì)；微量注射器；電子分析天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

本研究中所用的試劑主要包括：鯡魚精DNA、地西他濱、鹽酸小檗堿溶液、二次蒸餾水等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

配制DNA 溶液，方法是：用電子分析天平稱取一定量的鯡魚精DNA（簡(jiǎn)稱DNA），加入100 mL 的容量瓶中，并用二次蒸餾水定容至刻度。用紫外可見吸收光譜法確定其濃度和純度，并將其置于0℃～4℃的環(huán)境中保存。配制地西他濱溶液，方法是：用電子分析天平稱取一定量的地西他濱，加入100 mL 的容量瓶中，并用二次蒸餾水定容至刻度（使其濃度為10-3mol/L）。將其置于0℃～4℃的環(huán)境中保存。配制緩沖溶液：將稀鹽酸滴加到0.1 mol/L 的三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液中，借助pH 計(jì)將該溶液的pH 調(diào)節(jié)至4.0，即制得Tris-HCl緩沖溶液。用微量注射器在10 mL 的容量瓶中依次加入相同劑量的地西他濱溶液及不同劑量的DNA 溶液, 再加入相同量的Tris-HCl 緩沖溶液，加水稀釋至刻度，搖勻靜置，并測(cè)定熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。熒光測(cè)量的激發(fā)波長(zhǎng)為241 nm，熒光發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm。用微量注射器在10 mL 的容量瓶中依次加入相同劑量的DNA 溶液及不同劑量的地西他濱溶液，再加入相同量的Tris-HCl 緩沖溶液，加水稀釋至刻度，搖勻靜置后用烏貝路德黏度計(jì)測(cè)定黏度。用微量注射器在10 mL 的容量瓶中依次加入相同劑量的地西他濱溶液、DNA 溶液及不同量的KCl 溶液，然后再加入相同量的Tris-HCl 緩沖溶液，加水稀釋至刻度，搖勻靜置后，測(cè)定熒光強(qiáng)度。熒光測(cè)量的激發(fā)波長(zhǎng)為241 nm，熒光發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm。用微量注射器在10 mL 的容量瓶中依次加入相同劑量的鹽酸小檗堿溶液、DNA 溶液及不同劑量的地西他濱溶液，然后再加入相同量的Tris-HCl 緩沖溶液，加水稀釋至刻度，搖勻靜置后，測(cè)定熒光強(qiáng)度。熒光測(cè)量的激發(fā)波長(zhǎng)為241 nm，熒光發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜實(shí)驗(yàn)

2.1.1 DNA 存在下地西他濱的熒光發(fā)射光譜 本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，地西他濱的熒光發(fā)射光譜在530 nm 處出現(xiàn)最大發(fā)射峰，隨著DNA 的加入，530 nm 處熒光發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度逐漸降低，說(shuō)明DNA 和地西他濱可能通過(guò)結(jié)合形成了復(fù)合物。詳見圖1。

圖1 DNA 存在下地西他濱的熒光發(fā)射光譜

2.1.2 熒光猝滅機(jī)制 本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，DNA 對(duì)地西他濱的猝滅速率常數(shù)遠(yuǎn)大于各猝滅劑對(duì)生物大分子最大擴(kuò)散控制的碰撞猝滅常數(shù)；在溫度升高后，其猝滅常數(shù)基本不變。在地西他濱發(fā)生動(dòng)態(tài)猝滅時(shí)，其猝滅常數(shù)會(huì)隨溫度的升高而升高。由此可見，DNA 對(duì)地西他濱的熒光猝滅作用并非由分子間動(dòng)態(tài)碰撞引起，而是由二者形成復(fù)合物所引起的靜態(tài)猝滅作用。

2.1.3 地西他濱與DNA 二元絡(luò)合物的組成及其結(jié)合常數(shù)通過(guò)熒光-猝滅分子間的結(jié)合常數(shù)可推出靜態(tài)猝滅熒光強(qiáng)度與猝滅劑的關(guān)系[3]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，在25℃下，地西他濱與DNA 之間的結(jié)合常數(shù)為2.51×104L·mol-1，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1.1151，線性相關(guān)系數(shù)為0.9986。在40℃下，地西他濱與DNA 之間的結(jié)合常數(shù)為2.86×104L·mol-1，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1.1227，線性相關(guān)系數(shù)為0.9908。

2.1.4 地西他濱與DNA 結(jié)合反應(yīng)的作用力 不同藥物與DNA 之間相互作用力的類型也不盡相同。藥物與生物大分子最常見的作用力有氫鍵作用力、范德華作用力、靜電作用力、疏水作用力等。有研究表明，可根據(jù)熱力學(xué)公式計(jì)算出藥物與生物大分子之間作用力的熱力學(xué)參數(shù)，并據(jù)此判斷其相互作用力的類型。ΔH ＞0 及ΔS ＞0 可判定為疏水作用力；ΔH ＜0 及ΔS ＞0 可判定為靜電作用力；ΔH ＜0 及ΔS ＜0 可判定為氫鍵作用力或范德華作用力[4]。根據(jù)地西他濱與DNA 的結(jié)合常數(shù)進(jìn)行計(jì)算，可得出二者結(jié)合過(guò)程的熱力學(xué)函數(shù)，從而可判定地西他濱與DNA 之間的主要作用力為疏水作用力。

2.2 地西他濱對(duì)小檗堿-DNA 體系熒光強(qiáng)度影響的研究

鹽酸小檗堿（又叫黃連素）是一種異喹啉生物堿，由于其與DNA 有較強(qiáng)的相互作用，且可顯示出較好的光敏作用，故可將其作為熒光指示劑進(jìn)行研究[4]。其原理是在鹽酸小檗堿嵌入DNA 雙螺旋的堿基對(duì)之間后，可使原來(lái)較弱發(fā)射帶的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果數(shù)據(jù)證實(shí)，隨著地西他濱濃度的增大，小檗堿-DNA 體系熒光強(qiáng)度無(wú)明顯的變化。這說(shuō)明，地西他濱與DNA 之間的結(jié)合方式并非嵌入。

2.3 地西他濱與DNA 作用的黏度研究

黏度法是檢測(cè)溶液狀態(tài)下藥物與DNA 作用模式的重要手段之一。當(dāng)藥物與DNA 以靜電作用結(jié)合時(shí)，DNA溶液的黏度無(wú)明顯變化；當(dāng)藥物與DNA 的結(jié)合方式為嵌入時(shí)，為容納嵌入的配體，DNA 相鄰堿基對(duì)的距離會(huì)變大，導(dǎo)致DNA 螺旋增長(zhǎng)，從而使DNA 溶液的黏度增大[5]。本研究中為進(jìn)一步確定地西他濱與DNA 的結(jié)合方式，用烏貝路德黏度計(jì)測(cè)定了DNA 溶液在不同濃度地西他濱存在下的黏度變化。即向固定濃度的DNA 溶液中加入不同劑量的地西他濱，并計(jì)算其相對(duì)黏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DNA 溶液的相對(duì)黏度基本不變。這說(shuō)明，地西他濱與DNA 之間的結(jié)合方式并非嵌入。

2.4 離子強(qiáng)度對(duì)地西他濱-DNA 體系熒光強(qiáng)度的影響

某些鹽類陽(yáng)離子（如K+）與DNA 的磷酸基可通過(guò)產(chǎn)生靜電作用的方式發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用。若地西他濱與DNA 的相互作用為靜電作用，在地西他濱與DNA 溶液中加入K+時(shí)，K+會(huì)與地西他濱產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，從而可減弱地西他濱與DNA 之間的作用，使熒光猝滅程度減弱。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，當(dāng)離子強(qiáng)度升高時(shí)，地西他濱和鯡魚精DNA 的熒光強(qiáng)度都基本不變，猝滅程度無(wú)明顯變化。這表明，地西他濱與鯡魚精DNA 之間的相互作用類型并非靜電作用。詳見圖2。

圖2 離子強(qiáng)度對(duì)地西他濱-DNA 體系熒光強(qiáng)度的影響

為進(jìn)一步確定地西他濱和鯡魚精DNA 之間的作用模式，本實(shí)驗(yàn)用紫外光譜法研究了在不同濃度DNA 存在下地西他濱的圖譜變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在pH=4.0 的Tris-HC1 緩沖溶液中，地西他濱在194 nm 和238 nm 處有兩個(gè)吸收峰。這表明，鯡魚精DNA 的加入未對(duì)地西他濱UV 峰的位置產(chǎn)生影響。其在194 nm 處的吸收峰有下降趨勢(shì)，而在238 nm 處吸收峰的峰位和峰強(qiáng)均沒(méi)有變化?？梢?，地西他濱與DNA 的結(jié)合方式為溝槽結(jié)合。詳見圖3。

圖3 不同DNA 濃度下地西他濱的紫外吸收光譜圖

3 小結(jié)

本研究采用熒光法和紫外法對(duì)DNA 與地西他濱的相互作用進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明，在Tris-HCl 緩沖溶液（pH=4.0）中，DNA 對(duì)地西他濱熒光(530 nm) 產(chǎn)生了猝滅作用。根據(jù)其猝滅常數(shù)未隨溫度升高而變化，得出了其熒光猝滅機(jī)制是由形成復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅。進(jìn)一步通過(guò)計(jì)算，分析出DNA 與地西他濱的相互作用類型為疏水作用。根據(jù)地西他濱對(duì)配合物熒光強(qiáng)度的影響和與DNA 作用的黏度變化情況可知，地西他濱與DNA 的結(jié)合方式并非嵌入結(jié)合。由離子強(qiáng)度對(duì)地西他濱-DNA體系熒光強(qiáng)度的影響可知，地西他濱與DNA 的相互作用類型并非靜電作用。結(jié)合紫外光譜變化情況可知，地西他濱與DNA 的結(jié)合方式為溝槽結(jié)合。