張韻晨 方旭波 李瑩 夏偉榮 柴智 馮進(jìn) 陳小娥

摘要：使用馬脾鐵蛋白包封降血壓活性肽AHLL，通過(guò)紫外、熒光和圓二光譜研究AHLL荷載對(duì)HSF結(jié)構(gòu)的影響。在此基礎(chǔ)上，研究鐵蛋白包封對(duì)AHLL穩(wěn)定性以及體外胃腸道消化過(guò)程中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制活性的影響作用，并開(kāi)展復(fù)合納米顆粒（HSF-AHLL）的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。結(jié)果表明，AHLL載運(yùn)顯著降低了HSF的α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，而β-折疊結(jié)構(gòu)含量和無(wú)規(guī)卷曲含量增加，另外，包埋后HSF四重軸通道上的色氨酸微環(huán)境被改變。HSF-AHLL的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和紫外穩(wěn)定性明顯高于游離AHLL。在模擬胃消化過(guò)程中，結(jié)合態(tài)與游離態(tài)AHLL的ACE抑制活性在胃液中下降明顯，而在腸液中變化不明顯。HSF-AHLL在Caco-2細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)具有一定方向性。吸收（AP→BL）大于外排（BL→AP），HSF-AHLL在Caco-2細(xì)胞單層膜上以細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)為主，內(nèi)吞抑制劑和肽載體抑制劑對(duì)HSF-AHLL的轉(zhuǎn)運(yùn)沒(méi)有明顯影響，而脫氧膽酸鈉能打開(kāi)細(xì)胞間通路促進(jìn)其轉(zhuǎn)運(yùn);HSF-AHLL的轉(zhuǎn)運(yùn)與多藥耐藥蛋白抑制劑形成競(jìng)爭(zhēng)性抑制，HSF-AHLL的轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)溫度具有一定的依賴性，屬于能量依賴型轉(zhuǎn)運(yùn)。

關(guān)鍵詞：馬脾脫鐵鐵蛋白，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽;納米粒;Caco-2細(xì)胞模型;轉(zhuǎn)運(yùn)

中圖分類號(hào)：S188?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）20-0194-07

收稿日期：2020-12-12

基金項(xiàng)目：食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（編號(hào)：SKLF-KF-201712）。

作者簡(jiǎn)介：張韻晨（1996—），女，新疆克拉瑪依人，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：rhymezyc@163.com。

通信作者：方旭波，博士，教授，主要從事水產(chǎn)品加工與貯藏研究，E-mail：fxb70@163.com;李 瑩，博士，副研究員，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)與健康研究，E-mail：hijoly@163.com。

本試驗(yàn)所用的ACE抑制肽AHLL在前期的研究中已證明發(fā)現(xiàn)它可以有效抑制ACE活性，在原發(fā)性高血壓大鼠上具有一定降血壓效果[1]。但由于AHLL較不穩(wěn)定，容易被消化道里的胃蛋白酶、胰蛋白酶降解，從而影響ACE的抑制活性[2]，機(jī)體對(duì)活性肽AHLL的吸收隨之也受到影響。鐵蛋白結(jié)構(gòu)中包含氫鍵、鹽橋和疏水作用力[3]，但是，單獨(dú)用作納米載體時(shí)易受外界環(huán)境、pH值和溫度變化等影響。以往對(duì)鐵蛋白的研究中，它作為納米載體對(duì)鐵蛋白表面進(jìn)行修飾，利用其特有的結(jié)構(gòu)廣泛應(yīng)用在材料學(xué)、納米學(xué)[4-5]等方面，鐵蛋白經(jīng)過(guò)脫鐵處理后可包裹特定的活性負(fù)載物并對(duì)活性負(fù)載物起到靶向輸送的作用，這一方法已經(jīng)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域得到應(yīng)用[6]。鐵蛋白脫鐵后變化為特殊的空腔結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)可以通過(guò)自由擴(kuò)散的形式進(jìn)入空腔，通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合的作用力附和在鐵蛋白的空腔里。鐵蛋白包埋技術(shù)已經(jīng)很成熟，但由于對(duì)包載物質(zhì)的分子量有要求，因此包埋率較低。鐵蛋白殼具有高度保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，80 ℃高溫都不能使之變性的特性，亞基之間的氫鍵和疏水作用力可以維持三、四級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，運(yùn)用可調(diào)控手段，使其解散又重組為鐵蛋白分子納米[7]。蛋白載體在胃酸大環(huán)境和胃蛋白酶的作用下會(huì)被降解[8]，完整的運(yùn)載體系在小腸吸收完成前就會(huì)被破壞，蛋白質(zhì)載體的穩(wěn)定性受到多種因素的制約。若運(yùn)用多肽對(duì)蛋白載體進(jìn)行修飾使其形成較穩(wěn)定的復(fù)合納米體系，能夠穩(wěn)定蛋白本身在不定pH和溫度范圍內(nèi)的溶解性，抑制蛋白質(zhì)出現(xiàn)大量聚集沉淀和失去穩(wěn)定變性的現(xiàn)象[9]。另外，在胃酸的酸性大環(huán)境下，多肽通過(guò)包埋和靜電吸引作用包被于鐵蛋白的內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)中，阻止胃蛋白酶對(duì)其降解，進(jìn)入小腸后，蛋白載體完成有效吸收，因此多肽和蛋白質(zhì)可形成雙重結(jié)構(gòu)，協(xié)同改善運(yùn)載藥物的穩(wěn)定性、吸收性和生物活性的長(zhǎng)效發(fā)揮[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ACE抑制肽AHLL（純度>99%），上海強(qiáng)耀生物科技有限公司;馬脾鐵蛋白，美國(guó)Sigma Aldrich公司;MOPS緩沖液，美國(guó)Amresco公司;27 mmol/L透析袋（分子量為14 000），美國(guó)biosharp公司;乙腈（分析純），江蘇漢邦公司;三氟乙酸，上海源葉生物科技有限公司;Transwel1細(xì)胞培養(yǎng)板（聚碳酯膜直徑12 mm，孔徑0.4 μm ）、25 cm2卡氏細(xì)胞培養(yǎng)瓶，美國(guó)Corning公司;維拉帕米，MK-571，氧化苯胂，脫氧膽酸鈉，美國(guó)Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基（4.5 g/L D-葡萄糖）、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液、Hanks平衡鹽溶液，美國(guó)Gibco公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TGL-50WS型大容量高速離心機(jī)，鞏義市宏華儀器設(shè)備工貿(mào)有限公司;FRQ系列小型超聲波清洗機(jī)，杭州法蘭特超聲波科技有限公司;1260Infinity高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent 公司;GI20體外模擬消化系統(tǒng)，澳大利亞Nutriscan公司;JASCO-810 圓二色譜儀，日本JASCO公司;Alpha-1900Plus紫外分光光度計(jì)，上海普元儀器有限公司;F-7000熒光分光光度計(jì)，日本Hitachi 公司;500型精密電子天平，意大利BEL公司;DK-8D電子恒溫水浴槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SpectraMax M5/M5e多功能酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司;PLUS-E2-20TJ 實(shí)驗(yàn)級(jí)超純水機(jī)，南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司;二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，日本SANYO公司;BHC-1300ⅡA/B2型微生物潔凈安全柜，江蘇凈化設(shè)備有限公司;Millicell ERS-2電阻儀，美國(guó)Millipore公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 根據(jù)前期研究得出納米粒的最優(yōu)制備條件[11] 準(zhǔn)確稱取20 mg 的AHLL標(biāo)品制得濃度為20 mg/mL的AHLL母液，放置于4 ℃保存。取 2 mL 濃度為2 μmol/L的蛋白溶液（5 mmol/L MOPS，pH值為7.0），用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至2.0，在室溫環(huán)境下攪拌20～30 min，使蛋白逐步解離成單個(gè)亞基狀態(tài)，放置于磁力攪拌器上一邊攪拌一邊緩慢滴加20 μL AHLL母液（20 mg/mL），使其終濃度為200 μg/mL，此時(shí)蛋白和AHLL的物質(zhì)量之比為1 ∶200。在室溫環(huán)境下攪拌20～30 min 后，用1 mol/L NaOH將溶液pH值調(diào)至7.4后立即放置于4 ℃層析冷柜中攪拌2 h以上。攪拌完成后用孔徑為12 000～14 000 u的透析袋置于pH值為7.4的5 mmol/L MOPS溶液里進(jìn)行透析處理，以除去游離泥鰍源高活性降壓肽AHLL，透析期間每隔 4 h 換1次透析液，以此制得HSF-AHLL復(fù)合納米粒。經(jīng)檢測(cè)空殼的HSF的粒徑為19.62 nm，粒徑分布均勻。載入ACE抑制肽后，HSF-AHLL納米粒粒徑增大至28.19 nm，HSF-AHLL和HSF表面都帶負(fù)電荷，HSF的電位為-39.9 mV，HSF-AHLL的電位約-34 mV，載體鐵蛋白濃度在1～2 μmol/L 之間，AHLL的終濃度在100～200 μg/mL范圍內(nèi)，可制備出包封率20.94%的穩(wěn)定納米粒體系。

1.3.2 圓二色譜分析 調(diào)節(jié)樣品蛋白終濃度為1.2 μg/mL，掃描波長(zhǎng)范圍為200～280 nm，掃描溫度25 ℃，每點(diǎn)掃描時(shí)間2.5 μs，樣品池光程為10 mm，掃描速率是200 nm/min，掃描步長(zhǎng)為0.5 nm[12]。平均掃描3次。

1.3.3 熒光光譜分析 調(diào)節(jié)納米粒載體蛋白的終濃度為1.2 μg/mL。激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為285～500 nm，激發(fā)縫1 nm，發(fā)射狹縫5 nm[13]。對(duì)AHLL、HSF-AHLL進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描[14]。

1.3.4 紫外光譜測(cè)定 控制納米粒載體的蛋白終濃度為1.2 μg/mL。使用UV-6300紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)HSF、HSF-AHLL進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

1.3.5 復(fù)合納米粒溫度穩(wěn)定性的測(cè)定 將制備好的HSF、HSF-AHLL納米粒溶液分別置于不同溫度（60、70、80、90、100 ℃）的水浴鍋中孵育1 h后取樣，對(duì)照為游離的AHLL溶液。取樣后用高效液相法測(cè)定AHLL的剩余含量。

1.3.6 復(fù)合納米粒pH值穩(wěn)定性的測(cè)定 調(diào)節(jié)HSF、HSF-AHLL納米粒溶液pH值（2.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.4、8.0），磁力攪拌60 min和90 min后，用高效液相法測(cè)定AHLL的剩余量。

1.3.7 復(fù)合納米粒紫外穩(wěn)定性的測(cè)定[7] 將納米粒溶液經(jīng)紫外燈（20 W）照射24 h，期間每4 h取樣，選用游離的AHLL溶液作對(duì)照。用高效液相法測(cè)定AHLL的剩余量。

1.3.8 復(fù)合納米粒體外模擬胃腸消化反應(yīng) 模擬胃消化[15]，用鹽酸（0.1 mol/L）將AHLL、HSF-AHLL溶液pH值調(diào)至2.0，水浴加熱至37 ℃后，加入胃蛋白酶（加量比AHLL ∶胃蛋白酶=1 ∶20）在GI20體外模擬消化系統(tǒng)上恒溫酶解2 h。模擬胃消化總時(shí)長(zhǎng)120 min，于胃消化開(kāi)始后30 min取樣，取樣間隔時(shí)間30 min，取樣后立即放入沸水浴中滅酶10 min，測(cè)定經(jīng)過(guò)模擬胃消化后的ACE抑制活性變化。模擬腸消化[16]：樣品經(jīng)過(guò)模擬胃消化2 h后，用NaHCO3（1.0 mol/L）調(diào)節(jié)體系的pH值至7.0。繼續(xù)加熱至37 ℃，加入胰蛋白酶（加量比AHLL ∶胰蛋白酶=1 ∶20），在GI20體外模擬消化系統(tǒng)上恒溫酶解 2 h。在腸消化期間每隔1 h取樣1次于沸水浴中滅酶10 min，測(cè)定樣品的ACE抑制活性在腸消化結(jié)束后的變化情況。

1.3.9? ACE抑制活性測(cè)定方法[2，11] 取10 μL ACE溶液和10 μL樣品不混合地加入96孔板中，然后加入150 μL預(yù)熱過(guò)的底物（1.0 mmol/L FAPGG溶解于50 mmol/L Tris-HCl，pH值為7.5，包含 0.3 mol/L NaCl），使其開(kāi)始反應(yīng)。酶標(biāo)儀升溫至 37 ℃ 后立即放入96孔板，于340 nm檢測(cè)吸光度，檢測(cè)時(shí)間間隔為1 min，檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)為20 min?？瞻讓?duì)照為10 μL緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH值為7.5，包含 0.3 mol/L NaCl）。以吸光度（D340 min）為橫坐標(biāo)，檢測(cè)時(shí)間為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，取10～20 min的斜率計(jì)算。

ACE抑制率=1-（D抑制劑/D空白）×100%。

1.3.10 探究HSF-AHLL在Caco-2細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑 當(dāng)Transwell板上的Caco-2細(xì)胞的跨膜電阻>600 Ω·cm2、熒光黃表觀滲透系數(shù)Papp<1.0×10-6 cm/s時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)[7，17]。選用納米粒HSF-AHLL（100-200 μg/mL）作為供液，HBSS（pH值=7.4）溶液作為接收液，考察 10 μmol/L Gly-Pro[18]（肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑）、25 μmol/L氧化苯胂（內(nèi)吞抑制劑）和 100 μmol/L 脫氧膽酸鈉[19]（旁路轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)劑），對(duì)HSF-AHLL轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的影響。對(duì)于AP→BL轉(zhuǎn)運(yùn)：將0.5 mL樣品加入AP側(cè)作為供給池，同時(shí)BL側(cè)加入1.5 mL空白HBSS作為接收池;對(duì)于BL→AP的轉(zhuǎn)運(yùn)：將1.5 mL樣品加入BL側(cè)作為供給池，AP側(cè)加0.5 mL空白HBSS作為接收池，抑制劑加樣量200 μL，每次取樣150 μL，同時(shí)相應(yīng)地補(bǔ)加 37 ℃ 150 μL空白HBSS溶液，轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)長(zhǎng)為 120 min，所有試驗(yàn)都3次平行。樣品中AHLL含量用高效液相法測(cè)定。

1.3.11 不同外排抑制劑對(duì)HSF-AHLL在Caco-2細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運(yùn)影響 選用100 μmol/LP-糖蛋白抑制劑維拉帕米[20]，50 μmol/L多藥耐藥蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)取AP側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)液，測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)液中的藥物濃度。計(jì)算表觀滲透參數(shù)（Papp）和PDR值。

根據(jù)以下公式計(jì)算表觀滲透系數(shù)：

Papp=ΔQ/（Δt×A×C0） （cm/s）。

式中：ΔQ是累積轉(zhuǎn)運(yùn)量，為Δt內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)量，單位mg;A是Transwell膜表面積，單位cm2;C0為加入Caco-2細(xì)胞模型的樣品初始質(zhì)量濃度，單位μg/mL。

表觀滲透系數(shù)比PDR=Papp（BtoA）/Papp（AtoB）。

1.3.12 不同溫度對(duì)復(fù)合納米粒轉(zhuǎn)運(yùn)的影響：對(duì)于Caco-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)同“1.3.10”節(jié)，分別于 4、37 ℃培養(yǎng)，計(jì)算AP→BL和BL→AP的表觀滲透參數(shù)（Papp），分析溫度對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 HSF-AHLL納米粒的結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 圓二色譜分析

通過(guò)圓二色譜儀測(cè)定光譜區(qū)域范圍在200～280 nm內(nèi)的復(fù)合納米載體的二級(jí)結(jié)構(gòu)，以鐵蛋白在此光譜區(qū)域的數(shù)值作對(duì)比，觀察其變化情況。如圖1-A可觀察到HSF和HSF-AHLL在209.5 nm和218.5 nm有負(fù)的肩峰譜帶;復(fù)合納米粒HSF-AHLL在240～280 nm范圍內(nèi)的圓二光譜曲線與鐵蛋白的光譜曲線幾乎重疊在一起，說(shuō)明AHLL通過(guò)靜電吸引力作用被包埋進(jìn)HSF的空腔內(nèi)形成了復(fù)合納米粒，包埋過(guò)程對(duì)鐵蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有影響，HSF-AHLL納米粒的圓二色譜特征肩峰譜帶[21]在222 nm 和208 nm 處有出峰更能證明HSF-AHLL納米粒具有α-螺旋結(jié)構(gòu)，但與鐵蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)存在差異。

從表1可知，HSF-AHLL復(fù)合納米粒的α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量比HFS有所降低，但 β-折疊結(jié)構(gòu)含量和無(wú)規(guī)卷曲含量較HFS又有所增長(zhǎng)。蛋白質(zhì)分子α-螺旋結(jié)構(gòu)的降低和 β-折疊結(jié)構(gòu)的升高意味著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由規(guī)整向松散轉(zhuǎn)化[22]。出現(xiàn)這種情況可能是因?yàn)榻?jīng)過(guò)包埋處理后蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化[11]，蛋白的結(jié)構(gòu)較包埋前更加延展。α-螺旋結(jié)構(gòu)包含數(shù)量較多的氫鍵，整體緊密且沒(méi)有空腔，而β-折疊結(jié)構(gòu)較為無(wú)序，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的有序性與其某些功能性質(zhì)是相關(guān)聯(lián)的，β-折疊含量的增加有利于發(fā)揮蛋白質(zhì)的某些功能性質(zhì)[23]，例如有利于增強(qiáng)蛋白質(zhì)的柔韌性和擴(kuò)展性。經(jīng)過(guò)包埋處理后的HSF二級(jí)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)以上的變化，標(biāo)志著HSF的整體分子構(gòu)象從有序轉(zhuǎn)化為無(wú)序，與之相對(duì)應(yīng)的功能也隨著分子構(gòu)象的改變而變化。

2.1.2 熒光光譜分析

在以往研究中得知，色氨酸的典型發(fā)射曲線在激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)出現(xiàn)[24]。利用熒光光譜分析復(fù)合納米粒，如圖1-B所示，在310 nm波長(zhǎng)處附近產(chǎn)生內(nèi)源熒光，由此可以推測(cè)鐵蛋白中有色氨酸和絡(luò)氨酸的存在。圖1-B中復(fù)合納米粒HSF-AHLL的內(nèi)源熒光光譜強(qiáng)度在310 nm處發(fā)生了明顯的變化，可能是發(fā)生了淬滅現(xiàn)象，可以推測(cè)，由于包埋處理導(dǎo)致鐵蛋白四重軸通道上的色氨酸微環(huán)境有所改變。多肽AHLL與鐵蛋白的靜電結(jié)合，對(duì)鐵蛋白的分子結(jié)構(gòu)也存在些許影響。

2.1.3 紫外光譜分析

圖1-C反映的是HSF、HSF-AHLL的紫外可見(jiàn)光吸收光譜。它們?cè)诮贤鈪^(qū)（190～350 nm）的紫外光譜幾乎重疊，表現(xiàn)出相似的光譜特征。與文獻(xiàn)[25]記載的最大吸收峰波長(zhǎng)的出峰時(shí)間（212 nm和280 nm）基本一致。這種吸收峰的出現(xiàn)是由于鐵蛋白中存在帶有芳環(huán)的氨基酸殘基而造成的，吸收峰的強(qiáng)度與蛋白的濃度變化成正比。根據(jù)光譜變化可以確定，復(fù)合納米粒HSF-AHLL具有和鐵蛋白類似的大分子共軛結(jié)構(gòu)，并且AHLL通過(guò)包埋處理進(jìn)入鐵蛋白的空腔中，鐵蛋白的表面性質(zhì)沒(méi)有受到改變。

2.2 HSF-AHLL納米粒的穩(wěn)定性分析

2.2.1 AHLL納米粒的溫度穩(wěn)定性 由圖2可知，

在不同溫度下處理60 min，80 ℃處游離的AHLL降解了78.30%，而HSF-AHLL中的AHLL只降解了51.34%，其穩(wěn)定性提高了26.96百分點(diǎn)。80 ℃之后游離的AHLL降解率變化有所緩和，但包埋處理后的復(fù)合納米粒HSF-AHLL的降解率較AHLL而言普遍偏低。這一現(xiàn)象反映出復(fù)合納米粒HSF-AHLL的熱穩(wěn)定性明顯提高。由于鐵蛋白具有非常穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，在中性條件下加熱至80 ℃也不易變性[26]，ACE抑制肽AHLL通過(guò)疏水作用力或范德華力與鐵蛋白內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基穩(wěn)定結(jié)合，形成了HSF-AHLL復(fù)合物[11]，鐵蛋白的外殼相當(dāng)于一層堅(jiān)固的壁壘，起到隔絕溫度和保護(hù)的作用，其空腔內(nèi)部包裹著AHLL，在復(fù)雜的食品體系中可以減少AHLL與鐵蛋白外部的小分子發(fā)生反應(yīng)的概率，使AHLL更加穩(wěn)定。

2.2.2 AHLL納米粒的pH穩(wěn)定性的影響

將制備好的HSF-AHLL納米粒分別調(diào)pH值至2.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，置于磁力攪拌器上分別反應(yīng) 30 min 和60 min，再將pH值還原至7.4，在反應(yīng)期間取樣測(cè)定AHLL含量變化。由圖3可知，包封率在酸性和堿性環(huán)境下的變化明顯，但在中性環(huán)境下相對(duì)穩(wěn)定，可以推測(cè)中性環(huán)境最適于HSF-AHLL納米粒的保存。出現(xiàn)此種現(xiàn)象的原因是鐵蛋白自身特殊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，鐵蛋白在極酸或極堿性環(huán)境下極易變性，發(fā)生變性的蛋白會(huì)逐個(gè)解離成單個(gè)亞基的狀態(tài)，當(dāng)pH值由極酸或極堿還原成中性時(shí)，鐵蛋白會(huì)隨之變化，恢復(fù)成穩(wěn)定的球形結(jié)構(gòu)。

2.2.3 AHLL納米粒的紫外穩(wěn)定性

如圖4所示，AHLL和HSF-AHLL經(jīng)過(guò)紫外照射后，24 h內(nèi)游離的AHLL降解了87.28%，而HSF-AHLL包埋物中的AHLL降解了51.45%，其穩(wěn)定性分別提高了35.83百分點(diǎn)。所以，經(jīng)包埋處理后的復(fù)合納米粒HSF-AHLL受紫外輻照后的降解率明顯降低。

2.2.4 AHLL納米粒的體外消化

圖5所顯示的是，AHLL和HSF-AHLL經(jīng)過(guò)模擬體外胃消化1～3 h后進(jìn)入腸消化4～6 h，產(chǎn)物的ACE抑制活性變化。在胃部消化過(guò)程中，游離AHLL的ACE抑制活性明顯高于HSF包封的AHLL。一個(gè)可能的原因是，HSF將AHLL與外界環(huán)境阻隔，從而降低了其抑制活性。兩者的ACE抑制活性在2 h后明顯下降，預(yù)示AHLL在酸性環(huán)境下發(fā)生了降解，且游離態(tài)AHLL的下降幅度高于包封AHLL，可能與HSF的穩(wěn)態(tài)化保護(hù)效果有關(guān)。當(dāng)轉(zhuǎn)移到腸液中后，兩者的ACE抑制活性變化幅度不明顯。

2.3 HSF-AHLL納米粒在Caco-2細(xì)胞模型中的吸收機(jī)制

2.3.1 不同抑制劑處理HSF-AHLL在Caco-2細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運(yùn)分析

細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和肽載體介導(dǎo)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)是物質(zhì)跨腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的常見(jiàn)途徑。本試驗(yàn)采用肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑Gly-Pro[18]、內(nèi)吞抑制劑氧化苯胂和旁路轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)劑脫氧膽酸鈉[19]探討HSF-AHLL的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。從圖6中可以看出，HSF-AHLL在經(jīng)過(guò)Gly-Pro對(duì)肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體競(jìng)爭(zhēng)性的抑制和氧化苯胂對(duì)胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制120 min后，濃度變化與空白組對(duì)照相比差異并不明顯，而經(jīng)過(guò)促進(jìn)劑脫氧膽酸鈉處理的AHLL和HSF-AHLL的含量較高，說(shuō)明復(fù)合納米粒 HSF-AHLL 在Caco-2細(xì)胞單層膜上的主要轉(zhuǎn)運(yùn)方式是旁路轉(zhuǎn)運(yùn)，脫氧膽酸鈉屬于膽酸鹽類的細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)劑，對(duì)溶解磷脂相對(duì)有效，有利于旁路轉(zhuǎn)運(yùn)[27]。當(dāng)HSF-AHLL在Caco-2細(xì)胞單層上進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，能有效地打開(kāi)細(xì)胞通路從而促進(jìn)其在Caco-2細(xì)胞單層的轉(zhuǎn)運(yùn)。

在AP側(cè)或BL側(cè)分別加入P-糖蛋白抑制劑維拉帕米[21]、多藥耐藥蛋白抑制劑MK-571[28]。Caco-2細(xì)胞AP側(cè)存在2種主要的外排蛋白[11]，即 P-糖蛋白和多藥耐藥蛋白，其主要功能是通過(guò)抑制消耗能量，把細(xì)胞中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)排到細(xì)胞外，從而影響細(xì)胞自身對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收。轉(zhuǎn)運(yùn)120 min后，加入維拉帕米的Papp（AtoB）值為（27.12±0.54）×10-6 cm/s，PDR為0.23。說(shuō)明AHLL是P-糖蛋白的外排底物。加入MK-571的Papp（AtoB）值升高，Papp（BtoA）值沒(méi)有明顯的差異（圖7），PDR值降低10%，證明HSF-AHLL的轉(zhuǎn)運(yùn)與多藥耐藥蛋白抑制劑形成競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

2.3.2 不同溫度對(duì)復(fù)合納米粒轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn)溫度從4 ℃變化為37 ℃時(shí)，復(fù)合納米粒HSF-AHLL在Caco-2細(xì)胞單層的雙向吸收變化情況如圖8所示。轉(zhuǎn)運(yùn)溫度為37 ℃時(shí)AP→BL和BL→AP 2個(gè)方向的AHLL濃度相較4 ℃時(shí)有所增加，Papp（AtoB）從（6.75±0.34）×10-6 cm/s上升到（25.29±0.63）×10-6 cm/s，Papp（BtoA）從（2.18±0.11）×10-6 cm/s 上升到（6.27±0.27）×10-6 cm/s，溫度上升對(duì)HSF-AHLL在Caco-2細(xì)胞單層的轉(zhuǎn)運(yùn)起到了促進(jìn)作用。溫度扮演著能量依賴轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑的角色，溫度降低減少了細(xì)胞代謝，反之溫度升高細(xì)胞代謝也會(huì)增強(qiáng)，可以推測(cè)說(shuō)明HSF-AHLL的轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)溫度具有一定的依賴性，屬于能量依賴型轉(zhuǎn)運(yùn)。

3 討論與結(jié)論

從圓二色譜結(jié)果可知，經(jīng)過(guò)包埋處理后AHLL通過(guò)靜電吸引力作用被包埋進(jìn)HSF的空腔內(nèi)形成了復(fù)合納米粒，包埋過(guò)程對(duì)鐵蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有影響，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了些許的變化;紫外光譜結(jié)果說(shuō)明復(fù)合納米粒HSF-AHLL具有和鐵蛋白類似的大分子共軛結(jié)構(gòu)，并且AHLL通過(guò)包埋處理進(jìn)入鐵蛋白的空腔中，鐵蛋白的表面性質(zhì)沒(méi)有受到改變;熒光光譜結(jié)果說(shuō)明包埋處理改變了鐵蛋白在四重軸通道上的色氨酸微環(huán)境。

不同溫度處理60 min，HSF-AHLL中的AHLL只降解了51.34%，其穩(wěn)定性提高了26.96%，HSF-AHLLL 較游離的AHLL熱穩(wěn)定性明顯提高，HSF-AHLL納米粒在中性環(huán)境的穩(wěn)定性最好。

模擬體外胃腸消化說(shuō)明，在胃酸的大環(huán)境下鐵蛋白的亞基會(huì)打開(kāi)，復(fù)合納米粒HSF-AHLL進(jìn)入消化系統(tǒng)后，ACE抑制率低于游離的AHLL經(jīng)過(guò)體外消化后的抑制率;復(fù)合納米粒HSF-AHLL在腸道的中性條件下能夠穩(wěn)定地保持繼而被有效地吸收，ACE抑制活性明顯提高。

HSF-AHLL在Caco-2細(xì)胞單層膜上以細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)為主，內(nèi)吞抑制劑和肽載體抑制劑對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)沒(méi)有明顯影響，而脫氧膽酸鈉能打開(kāi)細(xì)胞間通路促進(jìn)其轉(zhuǎn)運(yùn)。

HSF-AHLL的轉(zhuǎn)運(yùn)與多藥耐藥蛋白抑制劑形成競(jìng)爭(zhēng)性抑制，HSF-AHLL的轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)溫度具有一定的依賴性，屬于能量依賴型轉(zhuǎn)運(yùn)。

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