鄧 瑩 劉 杰 李 香 魏學(xué)軍

黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 都勻 558000

玄參又名浙玄參、廣玄參、元參，是玄參科植物玄參ScrophularianingpoensisHemsl.的干燥根，具有滋陰降火、解毒散結(jié)的功效，主要用于治療熱入營(yíng)血、溫毒發(fā)斑、熱病傷陰、咽喉腫痛等癥[1]。研究[2]表明玄參的化學(xué)成分主要為環(huán)烯醚萜類、苯丙素苷類、有機(jī)酸類等，其有機(jī)酸中的肉桂酸具有抗菌、消炎、利膽、輕瀉等作用[3]，是玄參的生物活性成分之一。超聲波提取具有提取效率高、時(shí)間短、溶劑消耗少、污染少、提取工藝溫度低、能有效維持提取物的生物活性，且設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，是一種新型環(huán)保提取技術(shù)[4]。為優(yōu)化玄參中肉桂酸的超聲提取工藝，本實(shí)驗(yàn)在單因素考察的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化玄參肉桂酸超聲提取工藝的甲醇濃度、液固比、提取時(shí)間、提取次數(shù)，旨在為玄參肉桂酸的提取工藝提供參考。

1 材料與試藥

1. 1 試藥 實(shí)驗(yàn)用玄參采于貴州省遵義市道真縣中藥材種植基地，經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校中藥教研室李香教授鑒定為玄參科植物玄參ScrophularianingpoensisHemsl. 的根。肉桂酸對(duì)照品(批號(hào)：CHB190106，成都克洛瑪生物科技有限公司)。乙腈(色譜純)；其他試劑均為分析純。

1. 2 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀 (美國(guó)安捷倫公司)；SG - 4050C數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海碩光公司)；AE240電子分析天平(瑞士MettLer公司)；AS10200A 超聲波提取機(jī)(杭州匯爾公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水(40-60)；流速1 .0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)285 nm。色譜圖如圖1所示。

圖1 肉桂酸HPLC圖

2.2 供試品溶液制備[3]精密稱取玄參樣品粉末約1.0 g，置于三角瓶中，準(zhǔn)確移入30%甲醇50 mL，密塞稱重，浸泡1 h，超聲提取30 min，冷卻后，用30%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[3]制備質(zhì)量濃度為1、2、5、10、15、20 μg/mL的肉桂酸對(duì)照品溶液，按照“2.1”色譜條件測(cè)肉桂酸峰面積。以對(duì)照品色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)作線性回歸，得肉桂酸線性回歸方程為Y=867.8X-674.09(R2=0.9998)，表明肉桂酸在1～20 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 方法學(xué)考察 精密吸取0.1 mg/mL的肉桂酸對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定5次，測(cè)得峰面積的RSD值為0.14%。取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液，在0、6、12、24、48 h測(cè)定，結(jié)果峰面積的RSD值為1.29%。取玄參藥材粉末1.0 g，6份，精密稱定，按上述“2.2”項(xiàng)方法制備供試液，測(cè)定峰面積，結(jié)果峰面積的RSD值為1.06%。取0.5 g含量為1.97 mg的玄參粉末6份，精密稱定，每2份為一組，共為3組，各組中依次加入肉桂酸對(duì)照品0.98、1.97、2.96 mg，按“2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果 (n=6)

2.5 樣品含量測(cè)定 分別取3份玄參藥材粉末，各1.0 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算玄參中肉桂酸的平均含量為(6.68±0.08)mg/g(n=3)。

2.6 單因素實(shí)驗(yàn)

2.6.1 甲醇濃度考察 精密稱取玄參藥材粉末約1.0 g，5份，分別加20%、30%、40%、50%、60%甲醇30 mL，超聲提取20 min，提取1次，測(cè)定肉桂酸峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果如圖2所示。由圖可知，肉桂酸含量隨著甲醇濃度的增加而增加，當(dāng)用40%甲醇作為提取溶劑時(shí)，肉桂酸含量最高，而用50%甲醇提取所得的肉桂酸含量反而下降，可能是因?yàn)殡S著甲醇濃度的增加，玄參中醇溶性物質(zhì)溶出增多，與肉桂酸競(jìng)爭(zhēng)溶劑，故選擇40%甲醇作為提取溶劑。

圖2 甲醇濃度對(duì)肉桂酸含量的影響

2.6.2 液固比考察 精密稱取玄參藥材粉末約1.0 g，5份，分別以40%甲醇10、20、30、40、50 mL超聲提取20 min，提取1次，測(cè)定肉桂酸峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果如圖3所示，由圖可知液固比為40∶1時(shí)所提取的肉桂酸含量已趨于穩(wěn)定，與液固比為30∶1時(shí)差別不大，從節(jié)約溶劑的角度考慮，選擇液固比為30∶1來(lái)進(jìn)行工藝優(yōu)化。

圖3 液固比對(duì)肉桂酸含量的影響

2.6.3 超聲提取時(shí)間考察 取玄參藥材粉末約1.0 g，5份，精密稱定，分別加40%甲醇30 mL后，分別超聲提取10、20、30、40、50 min，提取1次，測(cè)定肉桂酸峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果如圖4所示，由圖可知肉桂酸含量隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，但當(dāng)超聲40 min時(shí)肉桂酸的含量與超聲30 min時(shí)無(wú)顯著差異，可能是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的增加，甲醇的揮發(fā)降低了甲醇的濃度影響了肉桂酸的溶出，從節(jié)約能源和提高效率的角度考慮，選擇超聲提取30 min來(lái)進(jìn)行工藝優(yōu)化。

圖4 超聲提取時(shí)間對(duì)肉桂酸含量的影響

2.6.4 提取次數(shù)考察 精密稱取玄參藥材粉末約1.0 g，4份，加入40%甲醇30 mL，超聲30 min，分別提取1次、2次、3次、4次，測(cè)定肉桂酸峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果如圖5所示，由圖可知提取至3次時(shí)肉桂酸含量已趨于穩(wěn)定，從節(jié)約資源和時(shí)間的角度考慮選擇提取3次來(lái)進(jìn)行優(yōu)化。

圖5 提取次數(shù)對(duì)肉桂酸含量的影響

2.7 超聲提取工藝優(yōu)選 結(jié)合單因素考察結(jié)果，選取甲醇濃度(A)、液固比(B)、提取時(shí)間(C)和提取次數(shù)(D)為影響因素，以玄參肉桂酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以直觀分析和方差分析判斷四個(gè)因素對(duì)玄參肉桂酸含量的影響，篩選最佳工藝。因素水平見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表2 因素與水平

表3 正交實(shí)驗(yàn)安排表及結(jié)果

表4 方差分析

由表3中各因素極差大小可知，影響玄參肉桂酸含量的因素順序?yàn)镈>A>B>C，其中A因素和B因素的R值相同，以極差值最小的C因素作為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，由方差分析結(jié)果表4可知，4個(gè)影響因素對(duì)玄參肉桂酸含量均無(wú)顯著性影響，因此結(jié)合K值，可選擇最佳提取工藝為A1B1C2D3，即用30%甲醇作為提取溶劑，液固比為20∶1，超聲提取3次，每次30 min。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn) 為進(jìn)一步驗(yàn)證優(yōu)選工藝的可行性，取玄參藥材粉末1.0 g，3份，精密稱定，按“2.7”項(xiàng)下優(yōu)化的最佳提取工藝條件提取，即加入30%甲醇20 mL，超聲提取3次，每次30 min，合并濾液定容至100 mL，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得玄參中肉桂酸的平均含量為(8.78±0.07)mg/g，與優(yōu)選前“2.5”項(xiàng)下樣品中肉桂酸含量相比較具顯著性差異(P<0.01)，RSD=1.05%。結(jié)果表明優(yōu)化的提取工藝科學(xué)合理、穩(wěn)定可行。

3 討論

根據(jù)肉桂酸的溶解性，試驗(yàn)選取了對(duì)人體相對(duì)安全的50%甲醇和50%乙醇來(lái)對(duì)玄參中的肉桂酸進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用50%甲醇作為提取溶劑時(shí)，玄參中肉桂酸的提取率更高，因此試驗(yàn)中用的提取溶劑為甲醇。此外，本試驗(yàn)還比較了回流提取法和超聲提取法對(duì)玄參肉桂酸含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取法所得肉桂酸含量高于回流提取法，且超聲提取法更省時(shí)、高效、節(jié)能。

肉桂酸具有輕瀉作用，而滋陰是玄參的主要功效，因此肉桂酸在玄參中的含量密切關(guān)系著玄參藥理作用的發(fā)揮[5]。對(duì)于玄參中肉桂酸的研究，文獻(xiàn)中多見(jiàn)含量測(cè)定[6-8]，但玄參中肉桂酸提取工藝研究筆者尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)到，為提高玄參中肉桂酸的提取率，本試驗(yàn)在預(yù)試驗(yàn)和單因素考察的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)玄參中肉桂酸的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并結(jié)合直觀分析和方差分析，篩選出了科學(xué)、合理的最佳工藝。3次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，優(yōu)選出的工藝所提取的玄參肉桂酸含量較高，RSD小于1.5%。

綜上，試驗(yàn)所得到的玄參中肉桂酸超聲提取工藝穩(wěn)定性好、專屬性強(qiáng)，可為玄參中肉桂酸的提取和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。該優(yōu)化工藝提取的肉桂酸對(duì)玄參藥理藥效作用的影響有待下一步深入研究。