鄭倩婧 劉亞飛 闕穎釗 于衛(wèi)華

肝細(xì)胞癌是一種高致死率的惡性腫瘤，是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大原因，其發(fā)病率呈穩(wěn)步上升趨勢(shì)[1]。肝癌的高侵襲性和轉(zhuǎn)移性阻礙腫瘤的徹底清除，是預(yù)后不良的關(guān)鍵因素[2]。因此，更全面地了解肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制是確定有效治療靶點(diǎn)的關(guān)鍵。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)是腫瘤周圍基質(zhì)的主要成分，通過(guò)與腫瘤細(xì)胞相互作用和對(duì)基質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)的機(jī)械重塑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲，促進(jìn)腫瘤向惡性腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散[3]。

生長(zhǎng)抑素(somatostatin，SST)是一種主要由下丘腦產(chǎn)生的激素，通過(guò)人體許多特定的受體在激素調(diào)節(jié)中起著不同的作用，在許多不同的組織和腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有SST受體轉(zhuǎn)錄本的存在[4]。研究報(bào)道CAFs參與肝癌的轉(zhuǎn)移與侵襲，但具體作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步明確[5]。SST對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響可能是通過(guò)抑制生長(zhǎng)因子和促生長(zhǎng)激素的合成或分泌而產(chǎn)生的間接作用，而CAFs則可分泌多種細(xì)胞因子來(lái)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[6-7]。因此，本研究探討了SST在CAFs中的表達(dá)及其與肝癌患者臨床病理參數(shù)、預(yù)后間的關(guān)系，并對(duì)SST和肝癌細(xì)胞間的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，以期為臨床研究提供新靶點(diǎn)。

材料與方法

一、基本資料

收集空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院2015年4月至2016年10月接受肝癌手術(shù)的83例患者的肝癌及癌旁組織(距離癌組織>3 cm)樣本，肝癌組織樣本中男性43例，女性40例，平均年齡(57.54±3.21)歲。收集患者的臨床病歷資料，包括年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織分化程度。所有納入標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)診斷均為肝細(xì)胞肝癌，患者術(shù)后采用門診或者電話等形式進(jìn)行定期隨訪，時(shí)間為每2個(gè)月一次，為期60個(gè)月，隨訪時(shí)間截至2020年3月，統(tǒng)計(jì)肝癌患者術(shù)后無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)和總體生存時(shí)間(OS)，比較術(shù)后生存率。所有患者均具有完整的隨訪資料，且術(shù)前均獲得知情同意。本研究均經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、研究方法

(一)細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌Huh7細(xì)胞購(gòu)于上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。CAFs和正常成纖維細(xì)胞(NFs)分別從肝癌及癌旁組織樣本中分離：將組織剪成小塊后加入適量含有20 %胎牛血清(Thermo公司)的RPMI 1640培養(yǎng)液(Thermo公司)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿后進(jìn)行傳代換液，換成正常培養(yǎng)液，取第4～7代纖維細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。所有細(xì)胞正常培養(yǎng)均用含有10 %胎牛血清、1 %青霉素鏈霉素(Gibco公司)的RPMI 1640培養(yǎng)液在37 ℃和5% CO2濃度的培養(yǎng)箱(上海精密儀器儀表有限公司)中培養(yǎng)。

(二)qPCR檢測(cè)肝癌組織中SST的表達(dá)水平 使用Trizol試劑從細(xì)胞中提取總RNA。然后用primerscript RT試劑盒將等量的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并作為RT-qPCR的模板。使用SYBR Premix二聚體試劑盒(中國(guó)大連Takara)測(cè)定基因表達(dá)。在25 μL反應(yīng)體積內(nèi)合成cDNA，其中12.5 μL SYBR預(yù)混劑Ex-TaqⅡ，1.0 μL RT引物和1 μL cDNA樣品，10.5 μL雙蒸餾水，qPCR程序在實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行，條件如下：95 ℃ 1 min，95 ℃ 35個(gè)循環(huán)20 s，然后56 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s。使用2-ΔΔCT方法分析靶基因的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR反應(yīng)引物序列

(三)細(xì)胞轉(zhuǎn)染、增殖與侵襲 細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑。CAFs 以1×105個(gè)細(xì)胞接種到24孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到70 %左右時(shí)，將2.5 μg的SST過(guò)表達(dá)載體(pcDNA-SST，美國(guó)Santa公司)與對(duì)照物(vector，美國(guó)Santa公司)分別于5 μL Lipofectamine RNAiMA共同混合在125 μL的無(wú)血清培養(yǎng)液中，然后與細(xì)胞共孵育。

采用CCK-8測(cè)定法檢測(cè)肝癌細(xì)胞增殖。肝癌相關(guān)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA-SST培養(yǎng)24 h后，取其上清液與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)，在0、24、48、72 h后，向每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8(上海儒安生物科技)溶液并與細(xì)胞共孵育另外2 h。在37 ℃下，用SpectraMax iD3多功能酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司)在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸收值。

將CAFs 以1×105個(gè)細(xì)胞接種到Transwell小室上層，下層接種Huh7細(xì)胞。共孵育24 h后，用棉簽除去未侵入的細(xì)胞，同時(shí)將侵入的細(xì)胞用4 %多聚甲醛中固定30 min，并用0.1 %結(jié)晶紫染色15 min。使用光學(xué)顯微鏡隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域定量染色的細(xì)胞。

(四)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) CAFs過(guò)表達(dá)SST后24 h，收集上清液與Huh7細(xì)胞共孵育24 h，然后在4 ℃以10 000 r/min離心5 min，通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中趨化因子CCL2、CCL5、CXCL21、CXCL25的含量。

(五)免疫蛋白印跡 用PBS洗滌細(xì)胞兩次后用RIPA裂解緩沖液(碧云天生物科技)裂解，蛋白質(zhì)濃度用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(Sigma公司)測(cè)定。然后用10 % SDS-PAGE分離等量的總蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5 %脫脂牛奶封閉2 h，然后在4 ℃下與一抗(Wnt1，1∶1 000稀釋，ab15251；β-catenin，1∶1000稀釋，ab32572；Cyclin D1，1∶200稀釋，ab16663；c-Myc，1∶500稀釋，ab32072，英國(guó)Abcam公司)孵育過(guò)夜。用TBS-T洗滌3次后，在室溫下與辣根過(guò)氧化物酶(1∶1000 稀釋, ab20272)共孵育1 h。用ECL成像系統(tǒng)(上海嘉鵬科技有限公司)顯示蛋白質(zhì)條帶，用imagej軟件定量蛋白質(zhì)條帶的光密度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、α-SMA、Vimentin及SST在 CAFs中的表達(dá)水平

如表2所示，采用qPCR檢測(cè)CAFs標(biāo)志物(α-平滑肌肌動(dòng)蛋白，α-SMA；波形蛋白，Vimentin)及SST的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示相對(duì)于NFs、α-SMA和Vimentin在CAFs中的表達(dá)水平顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。然而，SST在CAFs中的mRNA水平顯著低于NFs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 α-SMA、Vimentin及SST在 NFs和CAFs中的表達(dá)水平

二、 SST的表達(dá)與肝癌患者病理特征的關(guān)系

如表3所示，在83例肝癌患者中，男性43名例，女性40例；年齡在41～67歲之間，平均年齡為(57.54±3.21)歲；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期的有21例，Ⅲ+Ⅳ期的62例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者51例，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的32例；組織分化程度低的19例，組織分化程度中、高度的共64例。

表3 SST的表達(dá)與肝癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

肝癌患者按照SST表達(dá)分為SST高表達(dá)組(SST≥0.462)和SST低表達(dá)組(SST<0.462)。SST與臨床病理特征的關(guān)系顯示，SST的表達(dá)與患者的年齡、性別和腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)，與TNM分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織分化程度相關(guān)(P<0.05)。TNM分期高(Ⅲ+Ⅳ)、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移、肝癌組織分化程度中/高的患者，CAFs 中SST的表達(dá)水平越低；而TNM分期低(Ⅰ+Ⅱ)、淋巴結(jié)未發(fā)生轉(zhuǎn)移、組織分化程度低的肝癌患者，CAFs 中SST的表達(dá)水平偏高。

三、 SST對(duì)共培養(yǎng)肝癌細(xì)胞增殖的影響

從表4可知，與NFs細(xì)胞相比，培養(yǎng)CAFs的上清液與Huh7細(xì)胞共孵育后可顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而CAFs過(guò)表達(dá)SST后再與Huh7細(xì)胞共培養(yǎng)，與Vector組相比，pcDNA-SST組Huh7細(xì)胞的增殖受到抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 SST對(duì)共培養(yǎng)肝癌細(xì)胞增殖的影響

四、SST對(duì)共培養(yǎng)肝癌細(xì)胞侵襲的影響

比較肝癌細(xì)胞侵襲數(shù)發(fā)現(xiàn)，與Vector組(342±14)相比，過(guò)表達(dá)SST的CAFs與Huh7細(xì)胞共孵育，可顯著抑制Huh7細(xì)胞的侵襲數(shù)量(98±10)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=24.564，P<0.001)。

五、過(guò)表達(dá)SST對(duì)趨化因子的影響

為探討SST是如何通過(guò)CAFs影響Huh7細(xì)胞的增殖與侵襲，本文采用ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)NFs和CAFs上清液中趨化因子CCL2、CCL5、CXCL21和CXCL25的表達(dá)水平。結(jié)果顯示四種趨化因子CCL2(98.50±3.98)pg/mL、CCL5(78.32±4.21)pg/mL、CXCL21(24.32±5.11)pg/mL和CXCL25(20.34±4.77)pg/mL的表達(dá)水平在CAFs上清液中的表達(dá)水平顯著高于NFs組(3.2±5.36,1.40±4.35,1.02±4.67,1.11±5.01)pg/mL， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。表5顯示，與Vector組相比，趨化因子在轉(zhuǎn)染pcDNA-SST組中的含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 過(guò)表達(dá)SST對(duì)趨化因子的影響

六、SST通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移

Wnt/β-catenin通路被報(bào)道參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此我們通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Wnt/β-catenin通路是否參與SST對(duì)肝癌的抑制。表6結(jié)果顯示，與vertor組相比，CAFs轉(zhuǎn)染pcDNA-SST后，可顯著抑制Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白Wnt1、β-catenin、Cyclin D1和c-Myc的表達(dá)(P<0.01)，說(shuō)明SST通過(guò)Wnt/β-catenin通抑制Huh7細(xì)胞的增殖與侵襲。

表6 SST對(duì)Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

七、SST的表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier法被用來(lái)分析SST的表達(dá)與肝癌患者預(yù)后(PFS、OS)的關(guān)系。高表達(dá)SST的肝癌患者PFS(41.04%)、OS(39.77%)均顯著高于低表達(dá)SST肝癌患者PFS (8.27%)、OS(6.31%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.679，P=0.031；χ2=4.304，P=0.038)。

討 論

腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞相互作用是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵因素，CAFs是腫瘤微環(huán)境的組成部分之一，其通過(guò)分泌各種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，或與癌細(xì)胞的相互作用為腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了有利的微環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[8]。本文研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)CAFs與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，同樣可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖與侵襲，說(shuō)明CAFs也參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。

SST是一種參與多種生物化學(xué)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的肽，通過(guò)激活其同源受體負(fù)調(diào)控細(xì)胞增殖和多種激素的釋放，具有抗分泌、抗增殖和抗血管生成的作用，因此，在人類疾病治療方面特別是腫瘤具有優(yōu)異的效果[9]。天然的SST因?yàn)榕R床應(yīng)用半衰期短的原因而受到抑制，因此現(xiàn)階段的臨床研究多是其類似物，如SST的類似物奧曲肽，臨床治療顯示服用14.3個(gè)月后可顯著延緩腫瘤的進(jìn)展，表現(xiàn)出突出的抗增殖作用，且患者預(yù)后也較好[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，SST在CAFs中的表達(dá)水平顯著低于正常成纖維細(xì)胞，通過(guò)在CAFs中構(gòu)建SST的過(guò)表達(dá)載體，再與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，可顯著抑制肝癌的增殖與侵襲，說(shuō)明SST通過(guò)抑制CAFs與肝癌細(xì)胞的相互作用，抑制肝癌細(xì)胞的增殖與侵襲。

細(xì)胞因子/趨化因子家族在調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展和癌細(xì)胞間質(zhì)相互作用中同樣占據(jù)重要的位置。在口腔鱗狀細(xì)胞癌，CAFs通過(guò)增加單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1/CCL2)的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的侵襲和遷移[11]。在涎腺腺樣囊性癌中CAFs條件培養(yǎng)基對(duì)ACC細(xì)胞遷移和侵襲有顯著促進(jìn)作用，通過(guò)干預(yù)基質(zhì)金屬蛋白酶和CXCL12/CXCR4途徑，可以抑制CAFs促進(jìn)的ACC侵襲[12]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和腫瘤發(fā)生的經(jīng)典信號(hào)通路，可通過(guò)調(diào)控EMT的進(jìn)展參與腫瘤發(fā)生[13]。Shan等人報(bào)道Wnt/β-catenin信號(hào)通路是CXCL12過(guò)表達(dá)乳腺癌細(xì)胞上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化所必需的。因此當(dāng)CAFs與肝癌細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，趨化因子CCL2、CCL5、CXCL21、CXCL25和Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平顯著增加，而在CAFs中過(guò)表達(dá)SST后，四種趨化因子和Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)受到抑制，說(shuō)明SST是通過(guò)增加趨化因子和激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與肝癌的發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SST在肝癌患者癌旁組織的CAFs中表達(dá)下調(diào)，SST與肝癌患者臨床病理因素及預(yù)后相關(guān)，過(guò)表達(dá)SST可抑制肝癌細(xì)胞的增殖與侵襲，其機(jī)制可能與SST抑制CAFs分泌的趨化因子和肝癌細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。