倪磊 郭健 于雪 張凝 韓依影 楊瑜愛 楊建仁 李春蕊 賈娟 劉天華

肝癌作為世界范圍內(nèi)最為常見的惡性腫瘤之一，死亡率位居第四位，由于其本身惡性程度高、侵襲能力強(qiáng)、發(fā)展迅速，故而預(yù)后較差[1-2]。α-1,3巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶IV(α-1,3-fucosyltransferase IV, FUT4)可以催化巖藻糖殘基由UDP-Fuc轉(zhuǎn)移至N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine, GlcNAc )并形成α-1,3-糖苷鍵，從而參與路易斯抗原Y (Lewis antigen Y, LeY)的形成，其表達(dá)水平在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤轉(zhuǎn)移過程中均有所提高[3-6]。然而，在肝癌轉(zhuǎn)移過程中FUT4的表達(dá)及相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)特征的生物學(xué)過程[7]。EMT過程中，細(xì)胞會(huì)發(fā)生向紡錘形間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的轉(zhuǎn)變，以E-鈣黏蛋白(E-cadherin)等為代表的上皮標(biāo)志物的表達(dá)會(huì)發(fā)生下調(diào)，而以N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)等為代表的間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)會(huì)發(fā)生上調(diào)[8]。EMT能夠增強(qiáng)細(xì)胞的遷移、侵襲及抗凋亡能力，被認(rèn)為是大多數(shù)上皮細(xì)胞來源于惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)[9]。本研究主要通過檢測(cè)不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞以及人肝癌MHCC97L細(xì)胞EMT模型中FUT4的表達(dá)水平，并借助生物信息學(xué)分析獲取FUT4在轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移肝癌樣本中的表達(dá)水平和共表達(dá)基因，進(jìn)行KEGG通路富集分析，探究FUT4在肝癌轉(zhuǎn)移中的表達(dá)及機(jī)制，以期為肝癌轉(zhuǎn)移的診斷和治療提供新的思路和依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

(一)細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3為本實(shí)驗(yàn)室凍存，復(fù)蘇使用；其中MHCC97L為低轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞，MHCC97H、HCCLM3為高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞。

(二)試劑 TGF-β1(美國(guó)R&D公司)，RNA提取試劑盒(廣東廣州美基生物科技有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)ThermoFisher Scientific公司)，E-鈣黏蛋白抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，N-鈣黏蛋白抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，波形蛋白抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，GAPDH抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(上?？党缮锕こ逃邢薰?。

二、實(shí)驗(yàn)方法

(一)細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)所需人肝癌細(xì)胞MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

(二)人肝癌MHCC97L細(xì)胞EMT模型 人肝癌MHCC97L細(xì)胞以1×105/孔接種于六孔板中，采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。更換無血清DMEM培養(yǎng)基，加入10 ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)72 h，以無血清DMEM培養(yǎng)細(xì)胞為對(duì)照，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

(三)qRT-PCR檢測(cè) 采用RNA提取試劑盒提取不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞以及對(duì)照組和TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌MHCC97L細(xì)胞EMT模型組總RNA。以2 mg RNA為模板進(jìn)行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄合成，隨后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增程序設(shè)定為：95 ℃，5 min；95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，72 ℃，20 s，共40個(gè)循環(huán)；以GAPDH為內(nèi)參，所用引物序列如下： FUT4-forward 5′-TCCTACG-GAGAGGCTCAG-3′，F(xiàn)UT4-reverse 5′-CCTCGTAGTC-CAACACG-3′；E-cadherin-forward 5′-GAATGACAAC-AAGCCCGAAT-3′，E-cadherin-reverse 5′-GACCTCCA-TCACAGAGGTTCC-3′；N-cadherin-forward 5′-GGTG-GAGGAGAAGAAGACCAG -3′，N-cadherin-reverse 5′-CATCAGGCTCCACAGT-3′；Vimentin-forward 5′-TG-GTTGCTTCAAGGACACAT-3′，Vimentin-reverse 5′-GTTGCAGTGAGGGCAAGAA-3′；GAPDH-forward 5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′，GAPDH-reverse 5′-GAGGGGAGATTCAGTGTGGT-3′。

(四) Western blot檢測(cè) 提取對(duì)照組及TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌MHCC97L細(xì)胞EMT模型組總蛋白，經(jīng)BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒定量后與5×SDS上樣緩沖液混勻，煮沸。取等量蛋白上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE分離后，采用半干電轉(zhuǎn)移的方法將條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、GAPDH抗體稀釋液，4 ℃孵育過夜；0.1% TBST洗膜3次后加入二抗，室溫孵育1 h；0.1% TBST洗膜3次后采用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白條帶。

(五)生物信息學(xué)分析 采用人類腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Cancer Metastasis Database, HCMDB)檢索轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移肝癌樣本中FUT4的表達(dá)水平及共表達(dá)基因相關(guān)數(shù)據(jù)[10]。將FUT4及其共表達(dá)基因?qū)隣micsBean數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG通路富集分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，設(shè)定P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

一、FUT4在不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞中的表達(dá)

采用qRT-PCR檢測(cè)不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3中FUT4的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與低轉(zhuǎn)移潛能人肝癌MHCC97L細(xì)胞相比，高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞MHCC97H與HCCLM3中FUT4的表達(dá)水平均顯著提高(P<0.01)，分別為MHCC97L細(xì)胞中的4.99倍和6.08倍。

二、 TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌MHCC97L細(xì)胞EMT模型的建立

通過TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌MHCC97L細(xì)胞構(gòu)建EMT模型，于顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖1A所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)72 h后MHCC97L形態(tài)由多邊形變?yōu)榧忓N形。

qRT-PCR檢測(cè)對(duì)照組及TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌MHCC97L細(xì)胞EMT模型組EMT標(biāo)志分子的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果如表1所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)，為對(duì)照組的0.63倍；而間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白與波形蛋白表達(dá)水平均顯著提高(P<0.001)，分別為對(duì)照組的3.10倍和1.58倍。Western blot檢測(cè)對(duì)照組及TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌MHCC97L細(xì)胞EMT模型組EMT標(biāo)志分子的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示蛋白表達(dá)變化與mRNA表達(dá)變化一致(圖1B)。

表1 qRT-PCR檢測(cè)TGF-β1誘導(dǎo)MHCC97L細(xì)胞EMT標(biāo)志分子的表達(dá)水平

(A)TGF-β1誘導(dǎo)MHCC97L細(xì)胞的形態(tài)變化；(B)Western blot檢測(cè)TGF-β1誘導(dǎo)MHCC97L細(xì)胞EMT標(biāo)志分子的表達(dá)水平

三、FUT4在TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌MHCC97L細(xì)胞EMT模型中的表達(dá)

采用qRT-PCR檢測(cè)對(duì)照組及TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌MHCC97L細(xì)胞EMT模型組FUT4的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌MHCC97L細(xì)胞EMT模型組中FUT4的表達(dá)水平顯著提高(P<0.01)，為對(duì)照組的1.42倍。

四、 轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移肝癌樣本中FUT4的表達(dá)水平及共表達(dá)基因

通過HCMDB數(shù)據(jù)庫(kù)檢索轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移肝癌樣本中FUT4的表達(dá)水平及共表達(dá)基因的相關(guān)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)EXP00134 (Dataset ID: GSE40367)顯示，與非轉(zhuǎn)移肝癌樣本相比，轉(zhuǎn)移肝癌樣本中FUT4的表達(dá)水平提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2A)；并且進(jìn)一步獲取了包括SPINT1、FUT8、PROM1、ITGB8、 ITGA3、 ITGB4等在內(nèi)的200個(gè)FUT4共表達(dá)基因。

(A)HCMDB數(shù)據(jù)庫(kù)檢索轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移肝癌樣本中FUT4的表達(dá)(**, P<0.01)；(B)FUT4及其共表達(dá)基因的KEGG通路富集分析

五、FUT4及其共表達(dá)基因的KEGG通路富集分析

將由HCMDB數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得的FUT4共表達(dá)基因與FUT4一起輸入OmicsBean數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行KEGG通路富集分析。結(jié)果如圖2B顯示，富集到了腫瘤轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常(Transcriptional misregulation)、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)(Regulation of actin cytoskeleton)以及ECM受體相互作用(ECM-receptor interaction)等KEGG通路。

討 論

FUT4作為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族一員，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。已有文獻(xiàn)報(bào)道表明，F(xiàn)UT4可以作為乳腺癌早期診斷和病程監(jiān)測(cè)的潛在分子標(biāo)志物[4]。然而，關(guān)于肝癌轉(zhuǎn)移中FUT4的表達(dá)及相關(guān)機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究。基于此，本研究不僅通過檢測(cè)不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞中FUT4的表達(dá)證實(shí)了其在高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平顯著提高，并且通過TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌MHCC97L細(xì)胞建立了EMT模型，進(jìn)一步驗(yàn)證了FUT4表達(dá)的變化；此外，還借助生物信息學(xué)的方法獲取了轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移肝癌樣本中FUT4的表達(dá)水平及共表達(dá)基因，并且對(duì)FUT4及其共表達(dá)基因進(jìn)行了KEGG通路富集分析。

在KEGG通路富集分析結(jié)果中，共表達(dá)基因SPINT1、FUT8、PROM1等被富集到了腫瘤轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常通路。已有報(bào)道證實(shí)，SPINT1的表達(dá)水平與分化型甲狀腺癌的淋巴結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)高風(fēng)險(xiǎn)存在緊密關(guān)聯(lián)[11]。FUT8與FUT4同為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族成員，其可以通過影響TGF-β 受體促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[12]；在前列腺癌細(xì)胞中上調(diào)FUT8則可以通過影響胞外囊泡糖蛋白的糖基化修飾促進(jìn)轉(zhuǎn)移[13]。PROM1又被稱為CD133，目前已被證實(shí)在胰腺癌中其表達(dá)水平與淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14]。共表達(dá)基因ITGB8在肺癌中可以通過影響轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，改變侵襲表型，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用[15]；在結(jié)直腸癌中，ITGB8的異位表達(dá)則可以抑制細(xì)胞侵襲，影響腫瘤轉(zhuǎn)移[16]。ITGA3同樣為FUT4的共表達(dá)基因，通過敲減其表達(dá)可以抑制頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞的遷移侵襲[17-18]。而共表達(dá)基因細(xì)胞黏附分子ITGB4的高表達(dá)則已被證實(shí)與宮頸癌淋巴結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后存在密切關(guān)聯(lián)[19]。KEGG通路富集分析結(jié)果提示，共表達(dá)基因ITGB8、ITGA3以及ITGB4不僅參與了肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)，還參與了ECM受體相互作用。由此可見，F(xiàn)UT4及其共表達(dá)基因可能通過腫瘤轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、ECM受體相互作用等KEGG通路參與肝癌轉(zhuǎn)移過程。

總之，本研究完成了對(duì)FUT4在肝癌轉(zhuǎn)移中的表達(dá)及機(jī)制的初步探索，并且為肝癌轉(zhuǎn)移的診斷和治療提供了以FUT4為潛在生物學(xué)標(biāo)志物與靶點(diǎn)的新思路。