楊延周，陳敏慧，裴承斌

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點實驗室，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 銀川市第一人民醫(yī)院急診科，銀川 750001)

卵巢顆粒細胞在卵泡的生長發(fā)育過程中起著重要的作用[1]，顆粒細胞凋亡是導(dǎo)致卵泡閉鎖的因素之一[2-3]，而過度的卵泡閉鎖直接導(dǎo)致女性不孕。Gja1亦稱縫隙連接蛋白43(connexin43)，主要在卵巢顆粒細胞表達，Gja1基因敲除小鼠卵巢顆粒細胞增殖受損進而使得卵泡發(fā)育受限[4]。因此，Gja1可能通過調(diào)節(jié)顆粒細胞增殖促進卵泡發(fā)育。

MicroRNAs(miRNA)是一類長度為22～24 nt的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA[5]，miRNA通過識別靶基因3’-UTR的特異位點來調(diào)控靶基因并參與許多重要的細胞生理及病理過程，其中包括細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡、激素合成和分泌[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在卵泡生長發(fā)育、卵泡閉鎖、排卵、類固醇激素合成等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的作用[7-8]。此外，miRNA在卵巢癌、卵巢早衰(POF)、多囊卵巢綜合征(PCOS)等卵巢疾病中也發(fā)揮著重要的作用。與正常女性比較，POF患者血漿中miR-23a-3p的表達水平顯著升高，提示miR-23a-3p可能在POF中發(fā)揮著重要作用[9]。有報道發(fā)現(xiàn)，miR-23a參與調(diào)節(jié)人卵巢顆粒細胞的黃素化[10]。但miR-23a在卵泡發(fā)育及閉鎖過程中的作用機制還不完全清楚，因此，本研究旨在探究miR-23a-3p在大鼠卵泡發(fā)育及閉鎖過程中的作用機制，進而為揭示miR-23a-3p在哺乳動物卵泡發(fā)育及閉鎖過程中的作用提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實驗動物及試劑

1.實驗動物：21 d雌性SD大鼠，購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(動物許可證號：2020-0001)。大鼠在溫度18～22℃、濕度50%、保持明暗交替各12 h條件下飼養(yǎng)，給予標(biāo)準(zhǔn)的飼料喂養(yǎng)，并且自由飲食。所有的實驗操作均獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

2.主要試劑及儀器：miR-23a-3p模擬物/抑制劑及陰性對照試劑盒均購自廣州銳博，脂質(zhì)體2000(Invitrogen，美國)、TRIzol(Thermo，美國)、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo，美國)、熒光定量PCR(RT-PCR)試劑盒(Thermo，美國)、增強化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo，美國)、兔抗鼠Gja1單克隆抗體(Abcam，美國)、兔抗鼠GAPDH單克隆抗體(Cell Signaling Technology，美國)、HRP標(biāo)記的IgG二抗(Cell Signaling Technology，美國)、雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega，美國)、流式細胞檢測試劑盒(上海貝博生物)、孕馬血清促性腺激素(PMSG，寧波三生生物)、PCR克隆試劑盒(In-fusion，北京寶日醫(yī)生物)、PmirGLO雙熒光素酶載體(Promega，美國)、人HEK293T細胞(香港中文大學(xué)陳偉儀教授饋贈)；RT-PCR儀(7500，ABI，美國)、顯微鏡(BX53，Olympus，日本)、流失細胞儀(LSRFortessa X-20，MD，美國)、離心機(5417R，Eppendorf，德國)。

二、研究方法

1.體外轉(zhuǎn)染miR-23a-3p模擬物/抑制劑及分組：將6只21 d雌性SD大鼠隨機分為2組，根據(jù)參考文獻[11]，在大鼠一側(cè)卵巢囊一次性分別注射miR-23a-3p模擬物/抑制劑，在另一側(cè)卵巢囊分別注射miR-23a-3p模擬物對照組/抑制劑陰性對照，具體如下：(1)模擬物組：0.05 μl(20 mM) miR-23a-3p模擬物+0.03 μl脂質(zhì)體2000+5 μl生理鹽水；(2)模擬物對照組：0.05 μl(20 mM)miR-23a-3p模擬物陰性對照+0.03 μl脂質(zhì)體2000+5 μl生理鹽水；(3)抑制劑組：0.05 μl(20 mM) miR-23a-3p抑制劑+0.03 μl脂質(zhì)體2000+5 μl生理鹽水；(4)抑制劑對照組：0.05 μl(20 mM) miR-23a-3p抑制劑陰性對照+0.03 μl脂質(zhì)體2000+5 μl生理鹽水。轉(zhuǎn)染72 h后，處死大鼠并收集卵巢，將雙側(cè)卵巢固定于4%多聚甲醛或用液氮冷凍并于-80℃保存，備用。

2.卵巢顆粒細胞的分離及培養(yǎng)：根據(jù)本課題組前期建立的顆粒細胞分離方法[12]，分離并體外培養(yǎng)卵巢顆粒細胞。腹腔注射50 U PMSG，43 h后脫頸處死大鼠，收集卵巢并去除多余的脂肪組織，放入含有PBS的培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下用1 ml注射器針頭刺破卵泡，并用200目的細胞篩過濾掉卵母細胞，然后收集顆粒細胞濾液于離心管中，93g離心5 min，棄除上清及細胞碎片，將顆粒細胞接種至24孔細胞培養(yǎng)板，并在含有10%胎牛血清(FBS)+1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～48 h，然后分別接種于不同的孔板中備用。

3.顆粒細胞轉(zhuǎn)染及分組：24孔板每孔接種1×105個顆粒細胞，第2天待細胞密度達50%左右，轉(zhuǎn)染步驟按照試劑盒說明書進行。分組情況如下：(1)對照組：3 μl脂質(zhì)體2000+497 μl DMEM/F12培養(yǎng)基；(2)模擬物組：3 μl脂質(zhì)體2000+2.5 μl(20 mM) miR-23a-3p模擬物+494.5 μl DMEM/F12培養(yǎng)基；(3)模擬物對照組：3 μl脂質(zhì)體2000+2.5 μl(20 mM) miR-23a-3p模擬物陰性對照+494.5 μl DMEM/F12培養(yǎng)基；(4)抑制劑組：3 μl脂質(zhì)體2000+2.5 μl(20 mM) miR-23a-3p抑制劑+494.5 μl DMEM/F12培養(yǎng)基；(5)抑制劑對照組：3 μl脂質(zhì)體2000+2.5 μl(20 mM) miR-23a-3p抑制劑陰性對照+494.5 μl DMEM/F12培養(yǎng)基。

4.慢病毒載體構(gòu)建：干擾慢病毒及對照組載體構(gòu)建、病毒包裝、純化、滴度測定均按照文獻[13]進行。擴增Gja1干擾序列[13]：5′-AGAGCACGGCAAGGTGAAA-3′，對照序列：5′-TTCTCCGA-ACGTGTCACGT-3′，并構(gòu)建到慢病毒載體上，由上海生物工程公司測序，鑒定正確后，用293T細胞進行慢病毒包裝，即得Gja1干擾慢病毒及對照慢病毒。

5.慢病毒轉(zhuǎn)染及分組：在卵巢顆粒細胞中加入100 μl含有終濃度為6 μg/ml Polybrene的OPTI-MEM培養(yǎng)基，分別加入適量Gja1干擾慢病毒和對照慢病毒懸液(MOI=30)，即Gja1干擾組和對照組，6 h后替換成完全培養(yǎng)基。慢病毒轉(zhuǎn)染卵巢顆粒細胞72 h后收集細胞并提取RNA和蛋白，備用。

6.RT-PCR：提取并純化顆粒細胞總RAN及miRNA并分別逆轉(zhuǎn)錄為cDNA模板，進行RT-PCR，各操作步驟均按照試劑盒說明書進行。Gja1上游引物：5′-GGAAGCTTCTGGACAAGGTC-3′；Gja1下游引物：5′-GAGTGTTACAGCGAAAGGCA-3′；同時，以GAPDH為內(nèi)參，GAPDH上游引物：5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′；GAPDH下游引物：5′-AGGTGGAAGAATGGGAGTTG-3′，miR-23a-3p和內(nèi)參 U6序列由廣州銳博有限公司提供。

7.石蠟切片及HE染色：卵巢石蠟包埋操作及HE染色過程按照本課題組已發(fā)表文章[3，14]進行。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，閉鎖卵泡計數(shù)按照參考文獻方法[12，14]進行。

8.Western blot：提取總蛋白后應(yīng)用BCA法測定蛋白濃度，取30 μg蛋白裂解變性后，經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉室溫搖床震蕩封閉1 h，加入稀釋好的一抗(1∶1 000)，4℃搖床孵育過夜，應(yīng)用TBST洗膜3次(15 min/次)，加入稀釋好的二抗(1∶3 000)，室溫下孵育1 h后TBST振蕩沖洗3次(15 min/次)，根據(jù)化學(xué)發(fā)光試劑盒說明書加入適量發(fā)光液顯色、曝光。應(yīng)用Image J軟件對目的條帶進行灰度值分析，GAPDH為內(nèi)參。每組實驗設(shè)置3個重復(fù)，實驗重復(fù)3次。

9.生物信息學(xué)預(yù)測：利用IPA軟件預(yù)測在卵泡發(fā)育過程中miR-23a-3p可能的靶基因；利用軟件TargetScan(www.targetscan.org)及miRDB(http：//mirdb.org/)預(yù)測miR-23a-3p靶基因的結(jié)合位點。

10.雙熒光素酶實驗：擴增包含miR-23a-3p結(jié)合位點的Gja1基因3’-UTR片段，Gja1上游引物：5′-CTAGTTGTTTAAACGAGCTCGTGTGTGT-TTTGTCATTATTGGTACA-3′；Gja1下游引物：5′-GCAGGTCGACTCTAGACCAGT TACTACAAA-GTTCCTTTAGGC-3′。將所得序列克隆到PmirGLO雙熒光素酶載體上，并交于上海生物工程公司測序。

24孔板每孔接種1×105個293T細胞，第2天待細胞密度達50%左右，轉(zhuǎn)染293T細胞。分組情況如下：(1)模擬物組：0.1 μg重組質(zhì)粒+2.5 μl(20 mM) miR-23a-3p模擬物+3 μl脂質(zhì)體2000；(2)模擬物對照組：0.1 μg重組質(zhì)粒+2.5 μl(20 mM) miR-23a-3p模擬物陰性對照+3 μl脂質(zhì)體2000。48 h后收集細胞并檢測熒光素酶活性。每組設(shè)置3個重復(fù)，試驗重復(fù)3次。

11.流式細胞術(shù)：用0.25%的胰酶消化并收集卵巢顆粒細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，93g4℃離心5 min，棄上清；加入100 μl Binding Buffer，輕輕吹打至單細胞懸液；加入5 μl Annexin V-PE和5 μl 7-AAD Staining Solution，輕輕吹勻，避光、室溫孵育10 min；加入400 μl Binding Buffer，輕輕吹勻。樣品染色后在1 h內(nèi)用流式細胞儀對標(biāo)本進行定量分析，每管共檢測10 000個細胞。每組設(shè)置3個重復(fù)，試驗重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、miR-23a-3p對大鼠卵泡閉鎖的影響

大鼠卵巢轉(zhuǎn)染miR-23a-3p模擬物/抑制劑72 h后，利用HE染色檢測miR-23a-3p對大鼠卵泡閉鎖的影響。

HE染色結(jié)果顯示，miR-23a-3p模擬物組大鼠閉鎖卵泡數(shù)顯著高于miR-23a-3p模擬物對照組(P<0.05)，miR-23a-3p抑制劑組閉鎖卵泡數(shù)與miR-23a-3p抑制劑對照組比較無顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

A：各組SD大鼠卵巢組織形態(tài)(HE染色，紅色箭頭為閉鎖卵泡)；B：閉鎖卵泡數(shù)計數(shù)情況。與模擬物對照組比較，*P<0.05圖1 轉(zhuǎn)染miR-23a-3p模擬物/抑制物72 h后miR-23a-3p對大鼠卵泡閉鎖的影響

二、miR-23a-3p靶基因的預(yù)測及驗證

利用IPA軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在卵泡發(fā)育過程中miR-23a-3p可能有16個靶基因，如下：FSHR、Gja1(cx43)、IRS2、FGF2、FMR1、BCL2、FOXL2、KITGL、MCM9、SAFB、STATSB、VIP、SMAD4、SFRP1、IHH和FMR1(圖2A)。

利用在線軟件TargetScan和miRDB分析發(fā)現(xiàn)，Gja1基因的3’-UTR存在miR-23a-3p的結(jié)合位點(圖2B)。雙熒光素酶結(jié)果顯示：與模擬物對照組比較，模擬物組顯著地下調(diào)了熒光素酶活性(P<0.05)(圖2C)。

A：IPA軟件預(yù)測結(jié)果；B：miR-23a-3p與Gja1 3’-UTR結(jié)合位點；C：雙熒光素酶實驗。與模擬物對照組比較，*P<0.05圖2 miR-23a-3p靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測及驗證

三、轉(zhuǎn)染miR-23a-3p模擬物/抑制劑72 h后大鼠卵巢顆粒細胞中miR-23a-3p及Gja1的表達情況

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，在卵巢顆粒細胞中模擬物組miR-23a-3p表達水平顯著高于模擬物對照組，而Gja1顯著低于模擬物對照組(P<0.05)；抑制劑組miR-23a-3p和Gja1表達水平與抑制劑對照組比較無顯著性差異(P>0.05)(圖3)。

A：miR-23a-3p相對表達情況；B：Gja1相對表達情況。與模擬物對照組比較，*P<0.05圖3 轉(zhuǎn)染miR-23a-3p模擬物/抑制劑72 h后各組SD大鼠卵巢顆粒細胞中miR-23a-3p和Gja1的表達情況

Western blot檢測結(jié)果顯示，模擬物組Gja1表達水平顯著低于模擬物對照組(P<0.05)；抑制劑組Gja1表達水平與抑制劑對照組比較無顯著性差異(P>0.05)(圖4)。

A：Western blot檢測Gjal蛋白條帶圖；B：Gjal蛋白的灰度分析。與模擬物對照組比較，*P<0.05圖4 轉(zhuǎn)染miR-23a-3p模擬物/抑制劑72 h后各組SD大鼠卵巢顆粒細胞中Gja1的表達情況

四、miR-23a-3p對卵巢顆粒細胞凋亡的影響

SD大鼠卵巢顆粒細胞分別轉(zhuǎn)染miR-23a-3p模擬物/抑制劑72 h后，利用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，模擬物組細胞凋亡率顯著高于模擬物對照組(P<0.05)，抑制劑組細胞凋亡率與抑制劑對照組比較無顯著性差異(P>0.05)(圖5)。

注：與模擬物對照組比較，*P<0.05圖5 轉(zhuǎn)染miR-23a-3p模擬物/抑制劑72 h后各組SD大鼠卵巢顆粒細胞凋亡情況

五、轉(zhuǎn)染Gja1慢病毒干擾載體72 h后大鼠卵巢顆粒細胞中Gja1的表達情況

Gja1慢病毒干擾載體/對照載體分別轉(zhuǎn)染大鼠卵巢顆粒細胞72 h后，利用RT-PCR和Western blot實驗檢測細胞中Gja1的表達量。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，Gja1干擾組Gja1在mRNA水平及蛋白水平均顯著低于對照組(P<0.05)(圖6)。

A：Gja1基因相對表達情況；B：Western blot 檢測Gjal蛋白條帶圖及灰度分析。與對照組比較，*P<0.05圖6 轉(zhuǎn)染Gja1慢病毒干擾載體72 h后大鼠卵巢顆粒細胞中Gja1的表達情況

六、Gja1基因下調(diào)對SD大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響

Gja1慢病毒干擾載體轉(zhuǎn)染大鼠卵巢顆粒細胞72 h后，利用流式細胞術(shù)檢測顆粒細胞凋亡情況。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，Gja1干擾組的細胞凋亡率顯著高于對照組，提示轉(zhuǎn)染Gja1慢病毒干擾載體后顯著增加了卵巢顆粒細胞的凋亡(P<0.05)(圖7)。

注：與對照組比較，*P<0.05圖7 Gja1基因?qū)D大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響

討 論

卵泡發(fā)育是一個由基因、非編碼RNA、激素等多因素調(diào)控的過程，而其中任何因素的異常都可能導(dǎo)致卵泡發(fā)育異常甚至不孕。miRNA作為非編碼RNA的一種，其在卵泡發(fā)育、卵泡閉鎖、卵巢性疾病(POF、PCOS)中的作用越來越受到重視[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，參與卵泡發(fā)育及閉鎖的miRNA有數(shù)百種之多，目前發(fā)現(xiàn)，miR-215、miR-873、miR-450、miR-196等參與卵泡發(fā)育，而miR-202、miR-210、miR-1826、miR-1275等參與卵泡閉鎖[15-16]。隨著研究的深入，越來越多的參與卵泡發(fā)育及閉鎖的miRNA將會被鑒定出來。

有文獻報道，人血漿miR-23a-3p表達水平增加時，會促進POF[9]。此外，miR-23a-3p還參與黃素化卵巢顆粒細胞的凋亡[10]，但是其在卵泡發(fā)育及閉鎖中的作用還未完全揭示清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-23a-3p會誘導(dǎo)大鼠卵泡閉鎖(P<0.05)，而抑制miR-23a-3p表達對卵泡發(fā)育沒有顯著影響(P>0.05)，結(jié)果表明，miR-23a-3p參與調(diào)節(jié)大鼠卵泡的發(fā)育。卵泡的發(fā)育與閉鎖是顆粒細胞和卵母細胞相互作用的過程，顆粒細胞的凋亡是誘導(dǎo)卵泡閉鎖的主要因素之一[3]。在體外培養(yǎng)顆粒細胞中過表達miR-23a-3p可以促進卵巢顆粒細胞的凋亡(P<0.05)，而抑制miR-23a-3p的表達對顆粒細胞沒有顯著影響(P>0.05)。顆粒細胞miR-23a-3p的異常表達可能是導(dǎo)致卵巢卵泡閉鎖的主要因素。

miRNA主要通過與靶基因3’-UTR結(jié)合，進而調(diào)控靶基因的表達水平。miR-23a-3p通過結(jié)合靶基因參與許多的生物學(xué)過程。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-23a-3p通過靶向調(diào)節(jié)SMAD同源物5(SMAD5)參與人卵巢顆粒細胞的凋亡[10]，通過靶向調(diào)節(jié)Cullin蛋白家族3(CUL3)改變子宮內(nèi)膜容受性[17]，通過靶向調(diào)節(jié)原鈣粘附蛋白17(PCDH17)參與肝癌細胞增殖與凋亡[18]，通過靶向調(diào)節(jié)草魚生長停滯和DNA損傷誘導(dǎo)型45 ab(CiGadd45ab) 進而參與炎癥反應(yīng)及細胞凋亡[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，Gja1主要定位在顆粒細胞中并參與調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育，而下調(diào)Gja1會促進卵泡閉鎖及顆粒細胞凋亡[14]。本研究利用IPA軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在卵泡發(fā)育過程中Gja1可能為miR-23a-3p的靶基因。同時，我們利用在線軟件TargetScan和miRDB分析發(fā)現(xiàn)，Gja1基因3’-UTR區(qū)存在miR-23a-3p的結(jié)合位點。通過雙熒光素酶實驗進一步證實，miR-23a-3p通過與Gja1基因3’-UTR相結(jié)合進而調(diào)節(jié)Gja1的表達，此結(jié)果與Wang等[20]的研究結(jié)果一致。此外，Wang等[20]通過點突變實驗進一步證實Gja1基因3’-UTR存在miR-23a-3p的結(jié)合位點。本研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠卵巢中過表達miR-23a-3p時可以下調(diào)Gja1的表達，而Gja1下調(diào)后促進了卵巢顆粒細胞的凋亡，進一步誘導(dǎo)卵泡閉鎖[21]。從而證實Gja1為miR-23a-3p的靶基因，miR-23a-3p可能通過與靶基因Gja1的識別參與調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育及閉鎖。

綜上所述，miR-23a-3p通過靶向調(diào)節(jié)Gja1參與調(diào)節(jié)大鼠卵泡閉鎖及卵巢顆粒細胞的凋亡。