李 航，楊正祥

(1.成都市龍泉驛區(qū)婦幼保健院兒童保健科；2.成都市龍泉驛區(qū)第一人民醫(yī)院口腔科，四川 成都 610100)

兒童矮小癥是指兒童的身高低于同種族、同年齡、同性別健康兒童平均身高的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差以上，或者低于正常兒童生長曲線第3百分位[1]。目前矮小癥的發(fā)病率為2%～3%，其中特發(fā)性矮小(ISS)約占矮小患兒發(fā)病率的60%～80%，形勢不容樂觀[2]。ISS的發(fā)病原因包括生長激素缺乏、甲狀腺功能減退、慢性器質(zhì)性疾病、心理社會(huì)剝奪以及遺傳代謝疾病等[3-4]。目前，重組人生長激素(rhGH)對ISS治療效果較好，但是價(jià)格昂貴，且治療效果個(gè)體間差異較大，其療效可能與遺傳因素有關(guān)。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFB1)編碼基因位于19q13，該基因激活性突變導(dǎo)致其編碼蛋白轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)活性增高，引起骨轉(zhuǎn)換加快、肌肉生成減少，出現(xiàn)骨骼病變和肌肉異常[5]。相關(guān)研究[6]表明TGFB1基因多態(tài)性與骨干發(fā)育不良有關(guān)。TGFB1基因多態(tài)性有可能會(huì)影響rhGH對ISS的療效，但是相關(guān)研究報(bào)道較少。因此，本研究選取成都市龍泉驛區(qū)婦幼保健院就診的ISS患兒，rhGH治療前后記錄患兒身高相關(guān)指標(biāo)，觀察TGFB1基因多態(tài)性對ISS患兒rhGH治療效果的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2017年12月至2019年12月在本院以rhGH治療的ISS患兒67例，其中男37例，女30例，平均年齡(7.9±1.5)歲，平均身高(109.96±6.32)cm。納入標(biāo)準(zhǔn)：兒童的身高低于同種族、同年齡、同性別健康兒童平均身高的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差以上，或者低于正常兒童生長曲線第3百分位；生長速率緩慢，但是出生身高和身長在正常范圍內(nèi)；且在生長激素(GH)激發(fā)試驗(yàn)中，血清GH峰值<10 ng·mL-1。排除標(biāo)準(zhǔn)：染色體異常、系統(tǒng)性疾病或綜合征等引起生長受限的疾??；肝腎功能異常。所有患兒家屬均知情并簽署知情同意書。

1.2 治療方案

ISS患兒均給予注射用國產(chǎn)rhGH(安徽安科生物工程股份有限公司生產(chǎn))，0.1 U·kg-1·d-1睡前皮下注射，均治療1年。

1.3 指標(biāo)監(jiān)測

rhGH治療前后記錄所有ISS患兒的身高、體重、體重指數(shù)(BMI)以及身高均值標(biāo)準(zhǔn)差積分(SDS)，拍攝包括全部手骨、腕骨和撓尺干3～4 cm的左手正位X線片，采用Greulich-Pyle方法，由專業(yè)人士評(píng)定骨齡。采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測血清中的胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3(IGFBP-3)。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

查閱相關(guān)文獻(xiàn)[7]，選擇TGF-β1對應(yīng)目標(biāo)位點(diǎn)SNP序列號(hào)分別為rs4803455和rs22417115。由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)特異性引物以及合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 基因型檢測

抽取ISS患兒血液3 mL，抗凝，存儲(chǔ)、備用。使用10%氯化銨裂解血液中細(xì)胞，3500 r·min-1離心后去上清，洗滌白色沉淀后用去離子水溶解。使用ND5000超微量分光光度計(jì)(美國BioTek公司)檢測DNA濃度，最終使擴(kuò)增DNA含量在100 ng左右。隨后加入緩沖液2.0 μL、1.6 μL dNTP以及Taq酶0.2 μL。再加入0.15 μmol·L-1上下游引物0.5 μL，最后使用去離子水將反應(yīng)體系加至20 μL?；靹蛑蠓湃隩L998A型基因擴(kuò)增熒光檢測儀(西安天隆科技有限公司)進(jìn)行反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件設(shè)置如下：預(yù)變性，94 ℃ 2 min；擴(kuò)增(35個(gè)循環(huán))，94 ℃變性25 s，58 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s；再延伸，70 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物(10 μL)使用限制性內(nèi)切酶TaqⅠ進(jìn)行酶切(美國Biolab公司)。利用美國Beckman Coulter公司的CEQ 8000自動(dòng)序列測序儀對PCR產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測定，測序結(jié)果經(jīng)Chromas 2.22軟件進(jìn)行查看和分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ISS患兒基因分型PCR測序圖譜

67例ISS患兒血漿中提取DNA測序，rs4803455位點(diǎn)AA、AC、TT型和rs22417115位點(diǎn)TT、TG、GG型檢測見圖1。根據(jù)此結(jié)果對基因型分類。

A：rs4803455；B：rs22417115。圖1 rs4803455位點(diǎn)與rs22417115位點(diǎn)基因型檢測圖

2.2 ISS患兒基因分型結(jié)果分析

rs4803455位點(diǎn)AA基因型占比11.94%，AC基因型占比64.18%，CC基因型占比23.88%；rs22417115位點(diǎn)TT基因型占比22.39%，TG基因型占比61.19%，GG突變占比16.42%。對研究對象rs4803455、rs22417115基因的基因型頻率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)P值均小于0.05，其分布符合Hardy-Weillberg遺傳平衡定律。見表2。

表2 ISS患兒基因型結(jié)果 n=67

2.3 ISS患兒不同基因型各項(xiàng)指標(biāo)差異

rs4803455基因型患兒間治療前后身高差值(Δ身高)、BMI差值(ΔBMI)、身高SDS差值(Δ身高SDS)、骨齡的差值(Δ骨齡)、IGF-1差值(ΔIGF-1)以及IGFBP-3差值(ΔIGFBP-3)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。rs22417115基因型中GG型患兒Δ身高顯著高于TT型患兒(P<0.05)，rs22417115基因型中TG、GG型患兒ΔBMI、Δ身高SDS和ΔIGFBP-3均顯著高于TT型患兒(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 不同基因型患兒各項(xiàng)指標(biāo)治療前后差值比較

3 討論

ISS是矮小癥中最常見的種類，其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，有研究[8]認(rèn)為基因、激素、營養(yǎng)、環(huán)境等共同作用，導(dǎo)致機(jī)體生理病理的改變。ISS患兒如果未及時(shí)治療，其身高將顯著低于同齡人群[9]。rhGH相對于促性腺激素釋放激素類似物、芳香化酶抑制等對ISS治療效果較好，但是價(jià)格昂貴，且治療效果個(gè)體間差異較大，其療效可能與遺傳因素有關(guān)。有研究[5-6]表明，TGFB1基因多態(tài)性與骨骼生長有關(guān)，該基因激活性突變使TGF-β1活性增高，引起骨轉(zhuǎn)換加快、肌肉生成減少，出現(xiàn)骨骼病變和肌肉異常。因此，TGFB1基因多態(tài)性有可能會(huì)影響rhGH對ISS的療效。本研究發(fā)現(xiàn)，使用rhGH治療ISS患兒后，各項(xiàng)監(jiān)測指標(biāo)均有效改善。其中rs4803455基因型患兒間各項(xiàng)指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相對于正常rs22417115基因TT型，rhGH治療TG型和GG型患兒各項(xiàng)指標(biāo)均顯著改善，提示rs22417115基因的基因多態(tài)性能顯著影響rhGH對ISS患兒的治療效果。

ISS患兒因?yàn)樽陨砩砀邌栴}，更容易出現(xiàn)自卑、溝通能力差、社會(huì)活動(dòng)能力差情況。有研究[10-11]表明，細(xì)胞的周期、調(diào)節(jié)因子、自身免疫機(jī)制可能與ISS的發(fā)病有關(guān)，其中生長激素-胰島素樣生長因子(GH-IGF)軸異常是特發(fā)性矮小癥發(fā)生的主要原因。因此，基于GH-IGF軸為靶點(diǎn)開發(fā)的藥物對ISS患兒具有良好的療效。ISS為機(jī)體對GH的敏感性下降所致而體內(nèi)GH水平正?；蚵缘?rhGH為外源性的生長激素補(bǔ)充劑，緩解內(nèi)源性生長激素分泌不足導(dǎo)致的矮小癥。美國食品藥品管理局于2003年批準(zhǔn)rhGH治療ISS[12]。有研究[13]表明，rhGH治療ISS患兒可以提高最終身高約4～6 cm，其療效與年齡、骨齡、治療時(shí)間、遺傳因素等有關(guān)。本研究使用rhGH治療ISS患兒1年后發(fā)現(xiàn)，rhGH對ISS患兒身高的各項(xiàng)指標(biāo)均有明顯的改善作用，療效明顯；進(jìn)一步對患者進(jìn)行基因分型后發(fā)現(xiàn)，TGFB1基因rs22417115位點(diǎn)的基因多態(tài)性對rhGH的療效具有顯著的影響，rs22417115位點(diǎn)的基因突變后，顯著增加了rhGH的治療效果，使身高、BMI、身高SDS評(píng)分、以及內(nèi)源性IGFBP-3等指標(biāo)顯著上調(diào)。本研究結(jié)果證明了遺傳因素(TGFB1基因的多態(tài)性)為rhGH潛在療效的影響因素之一。

ISS的發(fā)病與體內(nèi)基因多態(tài)性有關(guān)，研究多集中在GH-IGF軸相關(guān)基因，如：胰島素樣生長因子受體(IGF-IR)基因單核苷酸多態(tài)性與ISS的發(fā)病有關(guān)，其rs1976667位點(diǎn)是ISS發(fā)病的危險(xiǎn)因素[14]。另外生長激素受體(GHR)基因位點(diǎn)多態(tài)性與ISS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。但在廣西瑤族兒童中，GHR基因3個(gè)位點(diǎn)rs4410646、rs12515480和rs2940913的多態(tài)性在ISS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與不同地區(qū)種族有關(guān)[16]。因此，當(dāng)給予外源性rhGH治療時(shí)，其療效受到IGF-IR以及GHR基因多態(tài)性的影響。有研究[17]表明，生長激素受體基因外顯子3(d3-GHR)對rhGH治療矮小癥的療效具有顯著影響。IGFBP-3上的rs2854744(A/C)、rs3110697(G/A)、rs2132570(A/C)和rs2854746(C/G)等4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)可能與rhGH促線性生長效應(yīng)有關(guān)[18]。TGFB1基因編碼的下游TGF-β1通過TGF-β/Smad3信號(hào)通路或者PP2A-AMPK-FoxO1信號(hào)通路調(diào)整多種細(xì)胞的周期與生長[19-20]。研究表明，TGFB1基因多態(tài)性與多種疾病有關(guān)，包括高血壓[21]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[5]、肝纖維化[22]等。TGFB1基因亦調(diào)控骨組織進(jìn)而影響人體身高，TGFB1基因突變導(dǎo)致骨發(fā)育不良，引起人體的矮小[6]。但是TGFB1基因多態(tài)性與rhGH對ISS的療效尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，rs4803455基因型患兒間各項(xiàng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相對于正常rs22417115基因TT型，rhGH治療TG型和GG型患兒各項(xiàng)指標(biāo)顯著改善，提示TGFB1基因部分位點(diǎn)的多態(tài)性與rhGH療效相關(guān)，其機(jī)制可能與上調(diào)血清中IGF-1和IGFBP-3的表達(dá)水平有關(guān)。已有研究[23]表明，維生素D受體基因多態(tài)性以及瘦素受體基因(LEPR)單核苷酸多態(tài)性對rhGH治療ISS的療效具有顯著影響。TGFB1基因rs22417115位點(diǎn)對rhGH療效的影響研究豐富了當(dāng)前研究內(nèi)容。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，TGFB1基因rs22417115位點(diǎn)對rhGH治療ISS患兒的療效產(chǎn)生了顯著影響。相對于正常rs22417115基因TT型，rhGH治療TG型和GG型患兒身高各項(xiàng)指標(biāo)顯著改善，其機(jī)制可能與上調(diào)血清中IGF-1和IGFBP-3的表達(dá)水平有關(guān)。未來可通過基因檢測等手段達(dá)到對ISS患兒的精準(zhǔn)治療作用。