于坤弘，楊欣潤，代雅杰，于殿宇**，羅淑年，文 野，何遠華

（1. 黑龍江北大荒豐威食品有限公司，哈爾濱 150010；2. 東北農業(yè)大學，哈爾濱 150030；3. 九三食品股份有限公司，哈爾濱 150060）

20世紀70年代，我國飼料工業(yè)嶄露頭角，隨著國家科學技術的發(fā)展，我國飼料產量也從世界倒數(shù)躋身于世界前沿[1-4]。隨之而來的是飼料行業(yè)的競爭變大，因此，飼料配方的改革和創(chuàng)新迫在眉睫[5]。飼料的配方向著更環(huán)保和更安全的方面發(fā)展。飼料安全方面：一開始為了保證牲畜的營養(yǎng)、治療疾病以及防止牲畜感染疾病，抗生素廣泛應用于飼料行業(yè)中。但隨著抗生素耐藥性的出現(xiàn)，人們擔心食用抗生素飼料喂養(yǎng)的牲畜的安全性問題[6-8]。因此，開發(fā)不含抗生素的飼料替代物[9]以及發(fā)酵生物飼料[10]愈發(fā)被大眾接受，因此，現(xiàn)在的飼料工廠的生產方向開始轉型。隨著發(fā)酵飼料的流行，豆粕作為大豆加工副產物，因其便宜的價格[11]、富含營養(yǎng)物質、加工方面而廣受歡迎，并且發(fā)酵豆粕飼料可以完美的解決使用抗生素帶來的不利影響，改善飼料的品質。飼料環(huán)保方面：由于飼料行業(yè)的飛速發(fā)展，飼料的產量愈來愈多，隨之而來的就是工廠產生的廢料廢渣的排放對環(huán)境污染的問題[12-14]。而微生物發(fā)酵可以將工業(yè)、農業(yè)生產的廢渣、廢料進行二次利用，并以此為原料生產更優(yōu)質的飼料和添加劑。既可以解決污染的問題，又可以節(jié)約成本。綜合以上兩方面，工業(yè)化生產發(fā)酵生物飼料成為飼料工廠的最優(yōu)化選擇。

生物發(fā)酵分為液體發(fā)酵和固體發(fā)酵，固體發(fā)酵在環(huán)保方面效果更加顯著，具有投資少、能耗低、技術簡單、產率高、發(fā)酵結束不需處理廢液等優(yōu)點[15]。盡管固態(tài)發(fā)酵豆粕具有很多優(yōu)勢，但是豆粕中含有的抗營養(yǎng)因子也不可忽視，大分子蛋白質和胰蛋白抑制劑是豆粕中最大的抗營養(yǎng)因子。大分子蛋白質很難被消化，積累在飼料中被牲畜食用，易造成腹瀉，影響牲畜的品質；胰蛋白酶抑制劑會抑制飼料內的胰蛋白酶的活性，導致胰蛋白難以降解，造成危害。根據郭凱[16]、謝鵬等[17]、蘇偉光[18]和王剛等[19]的研究可知，黑曲霉菌、釀酒酵母菌、枯草芽孢桿菌和植物乳酸桿菌在發(fā)酵飼料中消除抗營養(yǎng)因子起到很大作用。目前的研究有兩個菌種混合進行飼料發(fā)酵，但四個菌種混合發(fā)酵飼料的研究尚少。因此，本設計采用上述四種菌種混合進行工業(yè)化發(fā)酵飼料，旨在為工業(yè)化生產高蛋白飼料的擴大生產開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種和原料

黑曲霉菌、釀酒酵母菌、枯草芽孢桿菌、植物乳酸桿菌，廣西龐博生物工程有限公司，于實驗室提純；高溫豆粕（含45.06%的粗蛋白），九三糧油工業(yè)集團有限公司。

1.2 儀器與設備

烘箱：上?？茖W儀器廠；超凈工作臺：蘇州醫(yī)用儀器廠；YXQ-280MD型兩用手提式高壓殺菌鍋：上海經濟區(qū)沈蕩中新電器廠；全自動凱氏定氮儀：丹麥；氨基酸自動分析儀測定：西安精大檢測設備有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：土豆20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然。培養(yǎng)黑曲霉和釀酒酵母菌。

LB培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%g，瓊脂2%，pH自然。培養(yǎng)枯草芽孢桿菌。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母粉0.5%，K2HPO40.2%，檸檬酸二銨0.2%，乙酸鈉0.5%，葡萄糖2%，吐溫800.1%，MgSO4·7H2O 0.06%，MnSO4·4H2O0.03%，瓊脂2%，pH自然。培養(yǎng)植物乳桿菌。

1.4 測定方法

粗蛋白測定采用凱氏定氮法；胰蛋白酶抑制劑含量的測定使用GB/T21498-2008的方法；氨基酸的測定采用GB/T18246-2000的方法，使用氨基酸自動分析儀測定。

1.5 固態(tài)發(fā)酵高溫豆粕工業(yè)化生產高蛋白飼料的工藝研究

1.5.1 豆粕飼料發(fā)酵工藝流程 豆粕發(fā)酵飼料工藝流程如圖1所示。

圖1 豆粕發(fā)酵飼料工藝流程圖

流程圖說明：

（1）原料稱重

按照比例稱取原材料豆粕、MgSO4·7H2O、CaCl2、KH2PO4。豆粕是生產豆奶和豆腐的副產物，因此可能會摻入雜質，這會影響飼料的品質。因此，在稱重時還要進行初步篩選，除去大塊雜質，保證后續(xù)工作的進行。

（2）粉碎

原料在進行稱重后進行粉碎，使用前檢查篩網有無破損，并且定期進行檢查。粉碎效果對后面的混合過程以及最后的飼料品質有著重要的影響。

（3）混和

滅菌前，需要把原料與水混合，有一定濕度的原料可以加快滅菌的速度，實現(xiàn)更好的滅菌效果。

（4）滅菌

滅菌是生物飼料加工過程中必不可少的過程，滅過菌的生物飼料菌種組成內沒有雜菌，可以更好的進行后續(xù)的發(fā)酵過程。

（5）菌種純化

本設計中使用的菌種來自廣西龐博生物工程有限公司，購買的菌種要在實驗室進行純化，純化后的菌種用于后續(xù)的發(fā)酵，保證發(fā)酵飼料的品質。

（6）接種

在超凈工作臺上進行接種操作，整個過程要保證絕對無菌，以防止雜菌對飼料品質的影響。

（7）恒溫發(fā)酵

發(fā)酵是生產發(fā)酵飼料的關鍵過程，通過發(fā)酵，可以提高飼料的消化吸收，改善飼料的品質，增加飼料的適口性。根據單因素實驗來確定發(fā)酵的最適溫度和最適時間。

（8）烘干

發(fā)酵過后的原料通常呈糊狀，需要進行干燥處理，使其便于包裝、儲存和運輸。

（9）成品包裝

將干燥過后的產物進行封裝。工作人員要注意產品的包裝有無破碎，并且按規(guī)格進行稱取。如發(fā)現(xiàn)異常，需及時上報。

（10）產品發(fā)放

將合格的飼料產品發(fā)往各個訂貨商，減少運輸過程中的產品破損。

1.5.2 豆粕發(fā)酵飼料工藝條件的單因素實驗設計

（1）豆粕添加量的影響

實驗選用不同的豆粕添加量：89%、91%、93%、95%、97%；其他發(fā)酵參數(shù)：菌種比例2：3：1：1，接種量20%（v/m），料水比2：5，發(fā)酵時間120h，發(fā)酵溫度35℃，初始pH7.3。然后測定發(fā)酵產物粗蛋白和TI含量。

（2）菌種比例的影響

實驗選用不同的菌種比例：1：1：1：1、1：2：1：1、1：3：1：1、2：3：1：1、3：3：1：1；其他發(fā)酵參數(shù)：豆粕添加量為95%，接種量20%（v/m），料水比2：5，發(fā)酵時間120h，發(fā)酵溫度35℃，初始pH 7.5。然后測定發(fā)酵產物粗蛋白和TI含量。

（3）接種量的影響

實驗選用不同的接種量：16%、18%、20%、22%、24%，其他發(fā)酵參數(shù)：豆粕添加量為95%，菌種比例2：3：1：1，料水比2：5，發(fā)酵時間120h，發(fā)酵溫度35℃，初始pH7.5。然后測定發(fā)酵產物粗蛋白和TI含量。

（4）料水比的影響

實驗選用不同的料水比：1：2、1：3、2：3、2：5、3：5，其他發(fā)酵參數(shù)：豆粕添加量為95%，菌種比例2：3：1：1，接種量20%（v/m），發(fā)酵時間120h，發(fā)酵溫度35℃，初始pH7.5。然后測定發(fā)酵產物粗蛋白和TI含量。

（5）發(fā)酵時間的影響

實驗選用不同的發(fā)酵時間：48，72，96，120和144h；其他發(fā)酵參數(shù)：豆粕添加量為95%，菌種比例2：3：1：1，接種量20%（v/m），料水比2：5，發(fā)酵溫度35℃，初始pH7.5。然后測定發(fā)酵產物粗蛋白和TI含量。

（6）發(fā)酵溫度的影響

實驗選用不同的發(fā)酵溫度：32，33，34，35和36℃；其他發(fā)酵參數(shù)：豆粕添加量為95%，菌種比例2：3：1：1，接種量20%（v/m），料水比2：5，發(fā)酵時間120h，初始pH7.5。然后測定發(fā)酵產物粗蛋白和TI含量。

（7）初始pH的影響

實驗選用不同的初始pH：6.1、6.5、6.9、7.3、7.7；其他發(fā)酵參數(shù)：豆粕添加量為95%，菌種比例2：3：1：1，接種量20%（v/m），料水比2：5，發(fā)酵時間120h，發(fā)酵溫度35℃。然后測定發(fā)酵產物粗蛋白和TI含量。

1.6 豆粕發(fā)酵飼料工業(yè)化生產的原輔料消耗

工廠暫定日產量為20t，根據馬海鳳和馬海金[20]的研究可知，由干物質損耗約為為20%：

每日耗用原料量=20/（1-20%）=25（t/日）

每日耗用豆粕量=25×95%=23.75（t/日）

每日生產用水量=20×2.5=50（t/日）

每日生產MgSO4·7H2O 消耗量=25×2%=0.5（t/日）

每日生產CaCl2消耗量=25×1%=0.25（t/日）

每日生產KH2PO4消耗量=25×2%=0.5（t/日）

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 豆粕添加量對產物粗蛋白和TI含量的影響 如圖2所示，當豆粕添加量為95%時，產物中的粗蛋白含量最高達到50.12%，TI含量最低達到1.51%。這可能是由于豆粕的添加量較少時，豆粕的營養(yǎng)價值不能充分的發(fā)揮出來，所以產物的粗蛋白含量和TI值都普遍較低；而當豆粕的添加量增加后，產物中的粗蛋白含量有所增加，但由于豆粕含量的增加導致產物的TI值上升。

圖2 豆粕添加量對產物粗蛋白和TI含量的影響

2.1.2 菌種比例對產物粗蛋白和TI含量的影響 如圖3所示，當接種比例為2：3：1：1時，產物中的粗蛋白含量最高達到50.09%，TI含量最低達到0.74%。當枯草芽孢桿菌和植物乳酸菌比例為1時，產物的粗蛋白含量較多，這是由于兩者產生的蛋白酶較少，可以減少產物中的粗蛋白降解。此外，釀酒酵母菌提高產物的適口性，故而釀酒酵母菌的含量不可減少。

圖3 菌種比例對產物粗蛋白和TI含量的影響

2.1.3 接種量對產物粗蛋白和TI含量的影響 如圖4所示，當接種量為20%（v/m）時，產物中的粗蛋白含量最高達到50.73%，TI含量最低達到0.83%。在此條件外，當接種量增大時，TI值增加，反而蛋白質的含量減少。飼料內菌種的含量達到飽和后，繼續(xù)增大接種量，會加速菌種之間的競爭，不利于部分微生物的生存，影響飼料品質。

圖4 接種量對產物粗蛋白和TI含量的影響

2.1.4 料水比對產物粗蛋白和TI含量的影響 如圖5所示，當料水比為2：5時，產物中的粗蛋白含量最高達到50.62%，TI含量最低達到0.57%。微生物的生長、代謝和繁殖都離不開水，含量太少會抑制其活性，太多又會導致產物粘黏，阻礙大分子物質的降解。并且水還可以促進微生物物種之間的物質交換，加快營養(yǎng)物質的輸送，提高產物的營養(yǎng)價值。

圖5 料水比對產物粗蛋白和TI含量的影響

2.1.5 發(fā)酵時間對產物粗蛋白和TI含量的影響 如圖6所示，當發(fā)酵時間為120h時，產物中的粗蛋白含量最高達到50.59%，TI含量最低達到0.62%。一開始，隨著時間增加，產物中的TI值逐漸減少，粗蛋白含量逐漸增加，并在120h時達到極值。這可能是由于剛開始，營養(yǎng)物質在豆粕中的含量較多，隨著時間的進行，豆粕中的營養(yǎng)物質消耗嚴重，不足以供給微生物的降解，導致粗蛋白的產量降低下來。超過120h后，粗蛋白含量開始下降，可能是因為發(fā)酵時間過長，導致粗蛋白被降解成更小分子的多肽和氨基酸。

圖6 發(fā)酵時間對產物粗蛋白和TI含量的影響

2.1.6 發(fā)酵溫度對產物粗蛋白和TI含量的影響 如圖7所示，當發(fā)酵溫度為35℃時，產物中的粗蛋白含量最高達到50.84%，TI含量最低達到0.87%。由于每個菌種的最適溫度不同，當發(fā)酵溫度小于各菌種的最適溫度時，隨著溫度的上升，粗蛋白的含量會呈現(xiàn)上升的趨勢，TI值會呈現(xiàn)下降的趨勢。而當發(fā)酵溫度高于各菌種的最適溫度后，菌株老化，活力減弱，隨著溫度的上升，粗蛋白的含量會呈現(xiàn)下降的趨勢，TI值會呈現(xiàn)上升的趨勢。

2.1.7 初始pH對產物粗蛋白和TI含量的影響 如圖8所示，當初始pH為7.3時，產物中的粗蛋白含量最高達到50.92%，TI含量最低達到0.73%。初始pH不僅影響微生物生物合成的進行，還影響微生物生長速率。7.3的初始pH是混菌進行發(fā)酵高溫豆粕飼料的最適pH。

圖7 發(fā)酵溫度對產物粗蛋白和TI含量的影響

圖8 初始pH對產物粗蛋白和TI含量的影響

2.2 豆粕發(fā)酵飼料品質評價

2.2.1 飼料中的氨基酸 通過單因素實驗確定了最佳的發(fā)酵條件，豆粕中氨基酸的組成變化通過使用氨基酸自動分析儀檢測，結果如表1所示。氨基酸的含量從42.08%提高到了48.80%，發(fā)酵后比發(fā)酵前提升了6.72%。除丙氨酸等的含量有小部分減少，大部分氨基酸的含量都在顯著增加。賴氨酸和蛋氨酸這類對牲畜影響較大的氨基酸含量分別提高了0.57%和0.27%。

表1 豆粕發(fā)酵前后氨基酸組成變化 %

2.2.2 飼料的其他品質評價 在最佳發(fā)酵條件下，運用黑曲霉菌、釀酒酵母菌、枯草芽孢桿菌、植物乳酸桿菌的組合發(fā)酵豆粕，對發(fā)酵前后的顏色、氣味、粗蛋白含量、氨基酸含量和TI值進行比較分析。

由表2可知，發(fā)酵后的豆粕顏色由淺黃色變?yōu)辄S褐色，氣味由豆腥味變?yōu)橄愣刮?，粗蛋白含量提高?1.11%，氨基酸含量提高了10.24%。發(fā)酵后豆粕的TI值由30.42%下降到0.30%，近乎于沒有，說明發(fā)酵豆粕的品質良好。

表2 豆粕發(fā)酵前后的比較

3 討論

氨基酸發(fā)酵后的含量較發(fā)酵前提升了6.72%。這是由于發(fā)酵過程中，微生物產生了一些蛋白酶，蛋白質被分解成多肽，多肽又進一步降解為氨基酸，在一定程度上起到了改善發(fā)酵飼料品質的作用。這與李群華等[21]、孫日飛等[22]的研究結果一致。

發(fā)酵后的豆粕顏色變深，氣味由豆腥味變?yōu)橄愣刮叮值鞍缀亢桶被岷烤玫教岣?，說明大豆中的一些大分子物質被降解成蛋白質和氨基酸，底物中非蛋白氮、無機氮和抗營養(yǎng)因子等物質經過微生物作用轉化為營養(yǎng)價值更高的蛋白質和氨基酸從而使兩者數(shù)值上升[23]。發(fā)酵后豆粕的TI值由30.42%下降到0.30%，近乎于沒有，說明發(fā)酵豆粕的品質良好。這與湯佩芬和李三要[24]的研究結果一致。

通過對豆粕的發(fā)酵工藝條件的單因素分析，最終確定發(fā)酵豆粕飼料的最佳工藝參數(shù)分別為：豆粕添加量為95%，黑曲霉菌、釀酒酵母菌、枯草芽孢桿菌、植物乳酸桿菌的比例為2：3：1：1，菌種接種量20%（v/m），料水比2：5，發(fā)酵時間120h，發(fā)酵溫度35℃，初始pH為7.3，MgSO4·7H2O為2%，CaCl2為1%，KH2PO4為1%。在此條件下，工業(yè)化生產的豆粕飼料中蛋白質和氨基酸含量都顯著上升，TI值顯著下降。23.75t豆粕、50t生產用水、0.5tMgSO4·7H2O、0.25tCaCl2、0.5tKH2PO4可以做到每天生產20t高蛋白飼料。