韓 宇，溫玉瑋，杜美娟，遲 妍

（丹東市中醫(yī)院 內(nèi)一科，遼寧 丹東 118000）

糖尿病腎病（Diabetic nephropathy，DN）是一種慢性微血管并發(fā)癥，不僅是糖尿病患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是慢性腎臟疾病的主要原因。DN 最常見特征之一是腎小管間質(zhì)纖維化，它在糖尿病性腎損傷中早期出現(xiàn)，是一種慢性炎癥反應(yīng)，會加速腎衰竭[1]。先前的研究表明，高血糖、持續(xù)性炎癥或上皮損傷等均可引起腎小管間質(zhì)形成纖維化[2]。高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的內(nèi)皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（EMT）是腎小球硬化的關(guān)鍵過程，并且在包括E-鈣粘蛋白（E-cadherin）和α- 平滑肌肌動蛋白（α-SMA）在內(nèi)的多種因素的介導(dǎo)下，上皮細(xì)胞可能會失去其上皮特性，并且獲得間質(zhì)細(xì)胞特性[3]。目前研究顯示，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）不僅是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)分子，而且還是EMT 和腎纖維化的治療靶點(diǎn)，已經(jīng)成為廣大學(xué)者的關(guān)注焦點(diǎn)[4]。因此，減少炎癥及纖維化藥理方法是DN 的潛在治療策略。人參皂苷Rg1 作為傳統(tǒng)名貴中藥人參的主要活性成分，對多種疾病具有藥理作用，包括糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病和癌癥[5]。幾項(xiàng)研究證明了人參皂苷Rg1 具有抗炎和抗纖維化作用，并且能夠有效抑制腎炎[6]。然而，人參皂苷Rg1 是否能夠減輕高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和纖維化尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探究人參皂苷Rg1 對高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和纖維化的影響及其潛在的分子機(jī)制，以期為DN的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器

人腎小管上皮細(xì)胞HK-2（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；人參皂苷Rg1（北京百奧萊博科技有限公司，批號：0703-201921）；DMEM 低糖培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶（美國Gibco 公司，批號：C11995500BT、16000-044、25200-056）；CCK-8 試劑（美 國Abcam 公 司，批 號：ab1880）；IL-1β 和TNF-α ELISA 檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：0302160408、0302160410）；α-SMA、E-cadherin、Fn、TGF-β1、Smad 2 和Smad 3 單抗（美國CST 公司，批號：40995、13677、5274、4896、9260、8688）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：A0182）；BCA 蛋白濃度檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，批號：C1034）；RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時熒光定量PCR 檢測試劑盒和ECL 化學(xué)發(fā)光試劑（賽默飛世爾科技有限公司，貨號：AM1793、4374966、A25741、34580）；引物（上海生工生物工程有限公司）。

HF160W 型二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；NovoCyte 3008 型流式細(xì)胞儀（美國艾森生物有限公司）；MK3 型全自動 酶 標(biāo) 儀 和ABI7500 型 實(shí) 時 熒 光 定 量PCR 儀（美國Thermo公司）；CKX31 型 倒 置 熒 光 顯 微 鏡（日本奧林巴斯株式會社）；EPS200 型電泳儀（上海天能科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理

HK-2 細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM 低糖培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）中，置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行傳代，取對數(shù)增殖期的HK-2 細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8 實(shí)驗(yàn)

生長狀態(tài)良好的HK-2 細(xì)胞接種在96 孔板中，接種密度為5×104個/孔，放置在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞隨機(jī)分為四組，每組設(shè)6 個復(fù)孔，分別采用含0、10、20、40 μg/mL 人參皂苷Rg1 的DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，其中，0 μg/mL 的細(xì)胞作為空白對照組，48 h 時向每組各孔細(xì)胞中加入10 μL CCK-8 溶液，隨后放置在37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min，使用酶標(biāo)儀測定每孔細(xì)胞的光密度值（OD值），波長為450 nm，計(jì)算各組細(xì)胞的相對存活率，即相對存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值×100%。

1.4 細(xì)胞藥物處理和分組

對數(shù)期的HK-2 細(xì)胞隨機(jī)分為：正常對照組，即采用含5.5 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；高糖組，即采用含30 mmol/L 葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；低人參皂苷Rg1 組，即采用含30 mmol/L 葡 萄 糖+ 10 μg/mL 人 參 皂 苷Rg1 的DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；高人參皂苷Rg1 組，即采用含30 mmol/L 葡萄糖+ 40 μg/mL 人參皂苷Rg1 的DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

1.5 ELISA 實(shí)驗(yàn)

HK-2 細(xì)胞藥物處理48 h 后，收集各組HK-2 細(xì)胞上清液，按照ELISA 檢測試劑盒使用說明，使用酶標(biāo)儀測定450 nm 和570 nm 處吸光度值，分別計(jì)算各組細(xì)胞上清液中IL-1β 和TNF-α 的含量。

1.6 qPCR 檢測

藥物處理48 h 的各組HK-2 細(xì)胞以胰蛋白酶消化，收集到離心管中，采用RNA 提取試劑盒抽提總RNA，去除基因組DNA 后測定RNA 的濃度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以管家基因GAPDH 為內(nèi)參，以獲得的cDNA 為模板，使用實(shí)時熒光定量PCR 檢測試劑盒行qPCR 檢測，采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。引物信息見表1。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequence

1.7 Western blot 實(shí)驗(yàn)

HK-2 細(xì)胞藥物處理48 h 后，除去細(xì)胞上清液，加入適量PBS 洗滌3 次，加入細(xì)胞裂解液放置在冰上裂解細(xì)胞，收集各組細(xì)胞裂解液至離心管中，離心取上清（蛋白樣品），BCA 蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白樣品濃度。SDS-PAGE 緩沖液與蛋白樣品等比例混合，沸水浴10 min，致蛋白質(zhì)變性，取40 μg 蛋白加樣，行SDS-PAGE 電泳，隨后將蛋白濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，于5%脫脂奶粉封阻2 h，洗膜3 次，加入稀釋的相應(yīng)一抗（1 ∶1 000 稀釋），放置在4 ℃搖床孵育過夜，洗膜3 次，再加入二抗（1 ∶2 000 稀釋），室溫孵育2 h，洗膜3 次，滴加ECL 化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影，定影后轉(zhuǎn)移至暗室曝光，采集圖像后使用Image J 軟件分析條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P< 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg1 對HK-2 細(xì)胞活性的影響

不同濃度的人參皂苷Rg1 處理HK-2 細(xì)胞，48 h時采用CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，不同濃度人參皂苷Rg1 處理組HK-2 細(xì)胞活性無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2，提示人參皂苷Rg1 對HK-2 細(xì)胞的增殖活性無明顯影響。

表2 不同濃度的人參皂苷Rg1 對HK-2 細(xì)胞活性的影響（±s，n = 3）Tab. 2 Effects of different concentrations of ginsenoside Rg1 on HK-2 cell viability（±s，n = 3）

表2 不同濃度的人參皂苷Rg1 對HK-2 細(xì)胞活性的影響（±s，n = 3）Tab. 2 Effects of different concentrations of ginsenoside Rg1 on HK-2 cell viability（±s，n = 3）

人參皂苷Rg1/ （μg/mL） 相對存活率 / %0 100.00 ± 5.23 10 99.86 ± 6.96 20 98.75 ± 6.87 40 99.93 ± 5.80 F 0.027 P 0.994

2.2 各組炎性因子含量比較

ELIASA 實(shí)驗(yàn)檢測人參皂苷Rg1 對高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞炎性因子TNF-α 和IL-1β 含量的影響，與正常對照組相比，高糖組HK-2 細(xì)胞上清液中TNF-α 和IL-1β 的含量明顯增加（P＜0.05），與高糖組相比，低人參皂苷Rg1 組和高人參皂苷Rg1 組中TNF-α 和IL-1β 的含量有不同程度的減少（P＜0.05），與低人參皂苷Rg1 組相比，高人參皂苷Rg1組中TNF-α和IL-1β的含量減少 （P＜0.05），見表3。

表3 各組細(xì)胞上清液中炎性因子TNF-α 和IL-1β 含量的比較（±s，n = 3）Tab. 3 Comparison of the contents of inflammatory factors TNF-α and IL-1β in the cell supernatant of each group（±s，n = 3）

表3 各組細(xì)胞上清液中炎性因子TNF-α 和IL-1β 含量的比較（±s，n = 3）Tab. 3 Comparison of the contents of inflammatory factors TNF-α and IL-1β in the cell supernatant of each group（±s，n = 3）

注：與正常對照組相比，*P < 0.05；與高糖組相比，&P < 0.05；與低人參皂苷Rg1 組相比，#P < 0.05。

組別 TNF-α /（pg/mL） IL-6/（pg/mL）正常對照組 5.02 ± 0.47 6.47 ± 0.72高糖組 17.33 ± 1.21* 25.02 ± 2.33*低人參皂苷Rg1 組 11.21 ± 1.02& 18.05 ± 1.51&高人參皂苷Rg1 組 7.86 ± 0.89&# 11.68 ± 1.03&#F 95.601 83.165 P 0.000 0.000

2.3 各組HK-2 細(xì)胞中α-SMA、 Fn 和E-cadherin 表達(dá)水平比較

Western blot 檢測人參皂苷Rg1 對高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì) 胞 中α-SMA、 Fn 和E-cadherin 表 達(dá) 水 平的影響，與正常對照組相比，高糖組HK-2 細(xì)胞中α-SMA 和Fn 的 表 達(dá) 水 平 明 顯 升 高（P＜0.05），E-cadherin 的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與高糖組相比，低人參皂苷Rg1 組和高人參皂苷Rg1 組中α-SMA 和Fn 的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），E-cadherin 的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與低人參皂苷Rg1 組相比，高人參皂苷Rg1 組中α-SMA和Fn 的表達(dá)水平降低（P＜0.05），E-cadherin 的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），見圖1、表4。

表4 各組細(xì)胞中α-SMA、 Fn 和E-cadherin 的表達(dá)水平的比較（±s，n = 3）Tab. 4 Comparison of the expression levels of α-SMA, Fn and E-cadherin in each group of cells（±s，n = 3）

表4 各組細(xì)胞中α-SMA、 Fn 和E-cadherin 的表達(dá)水平的比較（±s，n = 3）Tab. 4 Comparison of the expression levels of α-SMA, Fn and E-cadherin in each group of cells（±s，n = 3）

注：與正常對照組相比，*P < 0.05；與高糖組相比，&P < 0.05；與低人參皂苷Rg1 組相比，#P < 0.05。

組別 α-SMA Fn E-cadherin正常對照組 0.40 ± 0.04 0.23 ± 0.02 0.54 ± 0.04高糖組 0.87 ± 0.08* 0.57 ± 0.05* 0.18 ± 0.01*低人參皂苷Rg1 組 0.63 ± 0.06& 0.40 ± 0.04& 0.33 ± 0.03&高人參皂苷Rg1 組 0.49 ± 0.05&# 0.30 ± 0.03&# 0.45 ± 0.04&#F 35.710 48.370 69.429 P 0.000 0.000 0.000

圖1 Western blot 檢測各組HK-2 細(xì)胞中α-SMA、 Fn 和E-cadherin 的表達(dá)水平Fig. 1 Western blot detection of the expression levels of α-SMA, Fn and E-cadherin in HK-2 cells in each group

2.4 各組HK-2 細(xì)胞中TGF-β1、Smad 2 和Smad3 mRNA 相對表達(dá)量比較

qPCR 技術(shù)檢測人參皂苷Rg1 對高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞中TGF-β1、Smad 2 和Smad 3 mRNA 相對表達(dá)量的影響，與正常對照組相比，高糖組HK-2細(xì)胞中TGF-β1、Smad 2 和Smad 3 mRNA 相對表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），與高糖組相比，低人參皂苷Rg1 組和高人參皂苷Rg1 組中TGF-β1、Smad 2和Smad 3 mRNA 相對表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），與低人參皂苷Rg1 組相比，高人參皂苷Rg1 組中TGF-β1、Smad 2 和Smad 3 mRNA 相對表達(dá)量降低（P＜0.05），見表5。

表5 各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad 2 和Smad 3 mRNA 相對表達(dá)量的比較（±s，n = 3）Tab. 5 Comparison of the relative expression of TGF-β1, Smad 2 and Smad 3 mRNA in each group of cells（±s，n = 3）

表5 各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad 2 和Smad 3 mRNA 相對表達(dá)量的比較（±s，n = 3）Tab. 5 Comparison of the relative expression of TGF-β1, Smad 2 and Smad 3 mRNA in each group of cells（±s，n = 3）

注：與正常對照組相比，*P < 0.05；與高糖組相比，&P < 0.05；與低人參皂苷Rg1 組相比，#P < 0.05。

組別 TGF-β1 Smad 2 Smad 3正常對照組 1.00 ± 0.10 1.00 ± 0.09 1.00 ± 0.10高糖組 1.84 ± 0.16* 1.71 ± 0.15* 2.42 ± 0.20*低人參皂苷Rg1 組 1.46 ± 0.12& 1.39 ± 0.11& 1.75 ± 0.14&高人參皂苷Rg1 組 1.21 ± 0.11&# 1.15 ± 0.10&# 1.39 ± 0.11&#F 25.203 21.865 53.493 P 0.000 0.000 0.000

2.5 各組HK-2 細(xì)胞中TGF-β1、Smad 2 和Smad 3蛋白表達(dá)水平比較

Western blot 檢測人參皂苷Rg1 對高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞中TGF-β1、Smad 2 和Smad 3 蛋白表達(dá)的影響，與正常對照組相比，高糖組HK-2 細(xì)胞中TGF-β1、Smad 2 和Smad 3 蛋白相對表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），與高糖組相比，低人參皂苷Rg1組和高人參皂苷Rg1 組中TGF-β1、Smad 2 和Smad 3 蛋白相對表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），與低人參皂苷Rg1 組相比，高人參皂苷Rg1 組中TGF-β1、Smad 2和Smad 3蛋白相對表達(dá)水平降低（P＜0.05），如圖2 和表6 所示。

圖2 Western blot 檢測各組HK-2 細(xì)胞中TGF-β1、Smad 2 和Smad 3蛋白表達(dá)Fig.2 Western blot detection of TGF-β1, Smad 2 and Smad 3 protein expression in HK-2 cells in each group

表6 各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad 2 和Smad 3 蛋白相對表達(dá)水平的比較（±s，n = 3）Tab. 6 Comparison of the relative expression levels of TGF-β1, Smad 2 and Smad 3 proteins in each group of cells （±s，n = 3）

表6 各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad 2 和Smad 3 蛋白相對表達(dá)水平的比較（±s，n = 3）Tab. 6 Comparison of the relative expression levels of TGF-β1, Smad 2 and Smad 3 proteins in each group of cells （±s，n = 3）

注：與正常對照組相比，*P < 0.05；與高糖組相比，&P < 0.05；與低人參皂苷Rg1 組相比，#P < 0.05。

組別 TGF-β1 Smad 2 Smad 3正常對照組 0.17 ± 0.01 0.41 ± 0.03 0.22 ± 0.02高糖組 0.32 ± 0.02* 0.65 ± 0.04* 0.55 ± 0.04*低人參皂苷Rg1 組 0.27 ± 0.02& 0.56 ± 0.03& 0.40 ± 0.03&高人參皂苷Rg1 組 0.22 ± 0.01&# 0.48 ± 0.03&# 0.27 ± 0.02&#F 50.00 29.861 79.273 P 0.000 0.000 0.000

3 討論

腎纖維化的特征是間質(zhì)纖維化、慢性炎癥和腎小球硬化等眾所周知，炎癥是DN 發(fā)病的主要因素[7]。在糖尿病條件下巨噬細(xì)胞會滲入腎臟并形成炎癥環(huán)境，進(jìn)而影響幾乎所有腎細(xì)胞，從而導(dǎo)致ECM 積累、纖維化、細(xì)胞功能障礙，最終導(dǎo)致蛋白尿[8]。此外，腎纖維化的發(fā)病機(jī)制包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的顯著積累。在調(diào)節(jié)這種病理學(xué)進(jìn)展的系統(tǒng)中，EMT 被認(rèn)為在進(jìn)行性腎纖維化和隨后的腎功能惡化中起關(guān)鍵作用[9]。先前的研究表明，高血糖會誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)蓄積，這是腎小管間質(zhì)形成的重要步驟[10]。因此，研究抗炎和抗纖維化策略可以為DN的治療提供新的方法。

人參皂苷Rg1 是中藥人參的主要活性成分，據(jù)報道具有多種藥理和生化作用。已有報道顯示人參皂苷Rg1 對各種疾病的影響[11]。然而，人參皂苷Rg1 對腎纖維化的影響仍有待充分闡明。本研究觀察了人參皂苷Rg1 對HG 誘 導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和纖維化的影響，并探究了其潛在機(jī)制。研究顯示，HG 能夠誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子和趨化因子，最終導(dǎo)致間質(zhì)免疫細(xì)胞滲透，腎小管損傷和纖維化[12]。本研究結(jié)果顯示，高糖組HK-2 細(xì)胞分泌的TNF-α 和IL-1β 的含量明顯高于正常對照組，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往研究相符，提示高糖可能通過炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)腎小管發(fā)生纖維化。然而，人參皂苷Rg1 處理能夠抑制高糖誘導(dǎo)的炎癥因子的分泌，提示人參皂苷Rg1 能夠抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)來改善腎纖維化。高糖誘導(dǎo)的EMT 是一個重要過程，導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。EMT 是上皮細(xì)胞喪失上皮特性，并獲得了間充質(zhì)細(xì)胞的典型特性的過程。EMT 在發(fā)育過程中促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動和新型組織類型的產(chǎn)生，并且也促進(jìn)了疾病的發(fā)病機(jī)理。先前的研究表明，腎小管上皮可以通過EMT 過程分化為成纖維細(xì)胞，這被認(rèn)為是腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制中的重要事件[13]。本研究Western blot 檢測結(jié)果顯示，高糖能夠促進(jìn)α-SMA 和FN 蛋白的上調(diào)以及E-cadherin 的下調(diào)，這與HK-2 細(xì)胞上皮表型向肌成纖維細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變有關(guān)。而人參皂苷Rg1 能夠部分恢復(fù)該過程。提示人參皂苷Rg1 通過阻礙EMT 抑制腎纖維化進(jìn)程。在腎纖維化中，TGF-β1 被認(rèn)為是EMT 和細(xì)胞外基質(zhì)積累的主要調(diào)節(jié)劑，因此可能是腎纖維化的潛在關(guān)鍵驅(qū)動因素[14]。TGF-β1 信號主要通過TGF-β1 受體介導(dǎo)的Smad 和非Smad 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在TGF-β1 刺激后，調(diào)節(jié)性Smads（包括Smad 2 和Smad 3）被募集到TGF-β1 受體，并通過磷酸化激活轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，在那里它們共同激活下游的纖維原蛋白表達(dá)[15]。本研究表明，人參皂苷Rg1 處理可通過直接下調(diào)TGF-β1、Smad 2 和Smad 3 來降低HG 誘導(dǎo)的EMT。

結(jié)果表明，人參皂苷Rg1 抑制HG 誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和EMT 來阻礙腎纖維化進(jìn)展，這可能是通過抑制TGF-β1/Smad信號通路來實(shí)現(xiàn)的。

4 結(jié)論

本研究表明人參皂苷Rg1 對HK-2 細(xì)胞無明顯毒性作用，高糖誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞能夠促進(jìn)TNF-α、IL-1β、α-SMA、Fn、TGF-β1、Smad 2 和Smad 3 的表達(dá)，抑制E-cadherin 的表達(dá)，而人參皂苷Rg1 能夠抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2 炎癥反應(yīng)和EMT，并抑制TGF-β1/Smad 信號通路的激活。人參皂苷Rg1 通過抑制TGF-β1/Smad 信號通路緩解高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)和纖維化，這為人參皂苷Rg1 治療糖尿病腎病提供新的方向。