謝 靜，鄭 抒，秦 劍

(重慶食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121)

染發(fā)劑作為一種發(fā)用化妝品應(yīng)用歷史悠久，經(jīng)過長期的發(fā)展到現(xiàn)在已經(jīng)擁有很多系列，其中氧化型染發(fā)劑由于其染發(fā)效果好、持續(xù)時間長而應(yīng)用最廣泛[1]。羥乙基對苯二胺硫酸鹽和對苯二胺都屬于氧化型染發(fā)劑，有研究表示[2]羥乙基對苯二胺硫酸鹽較對苯二胺有更強的染發(fā)效能，而且對頭發(fā)損傷更小，所以其在染發(fā)劑中被廣泛使用，目前國家標準中規(guī)定了75種染發(fā)劑的限度要求[3]，其中就包括羥乙基對苯二胺硫酸鹽和對苯二胺，但是在檢驗方法上存在巨大的空白[4]。羥乙基對苯二胺硫酸鹽與對苯二胺是化學性質(zhì)相近的兩種物質(zhì)，目前染發(fā)劑檢驗的國家標準是化妝品安全技術(shù)規(guī)范2015年版規(guī)定[5]的32種染發(fā)劑的檢驗法，但是方法中的32種染發(fā)劑并不包括羥乙基對苯二胺硫酸鹽，實驗中發(fā)現(xiàn)，以此種方法檢驗時，羥乙基對苯二胺硫酸鹽和對苯二胺在同一時間出峰，并且兩種物質(zhì)的紫外圖譜一致，在實際檢驗工作中，極易造成錯誤，將樣品中含有的羥乙基對苯二胺硫酸鹽當作對苯二胺檢驗。另外，在檢驗過程中發(fā)現(xiàn)染發(fā)劑生產(chǎn)企業(yè)在投料時也經(jīng)常將二者混淆。所以說，建立一種新的高效液相色譜方法，能使二者有效的分離，又能彌補羥乙基對苯二胺硫酸鹽在檢驗方法上的空白，實在是迫在眉睫。此次試驗旨在解決這一問題。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

Waters e2695型高效液相色譜儀-二極管陣列檢測器，美國Wterse公司。

標準品羥乙基對苯二胺硫酸鹽，購自damas-beta(批號P03568)；對苯二胺，購自CHEN SERCICE(批號7799500)；亞硫酸氫鈉、十二水和磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、庚烷磺酸鈉、無水乙醇均為分析純，甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水。染發(fā)劑5批，其中1批為液體，其余四批為乳膏狀。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：SUPELCO C18柱(25 cm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈+磷酸鹽緩沖液(十二水和磷酸氫二鈉1.8 g、磷酸二氫鉀2.8 g、庚烷磺酸鈉1.0 g加水定容至1000 mL,，磷酸調(diào)pH至6.0)=13:87；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm；進樣量：5 μL。

1.2.2 標準溶液的配制

精密稱取羥乙基對苯二胺硫酸鹽、對苯二胺對照品0.05 g(精確到0.05000 g)分別至25 mL容量瓶中，前者用2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液溶解并定容，后者以無水乙醇+2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液(1+1)混合溶液溶解并定容，配制成濃度為2 mg/mL的標準儲備液，精密量取上述單表儲備液各5.0 mL至同一25 mL容量瓶中，用無水乙醇+2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液(1+1)混合溶液稀釋至刻度，配制成濃度為400 μg/mL的混合標準溶液。

1.2.3 樣品的制備與檢測

精密稱取樣品0.2 g置于10 mL離心管中，加無水乙醇+水(1+1)的混合溶液至刻度，渦旋3 min，振蕩提取30 min，離心，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試液進樣分析。

1.2.4 方法學考察

線性關(guān)系：精密量取對照品溶液適量，用無水乙醇+2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液(1+1)混合溶液稀釋至濃度為8 μg/mL、16 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL的線性標準溶液。將線性標準溶液注入液相色譜儀，得到峰面積，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標得到回歸方程。精密度：濃度為40 μg/mL的混合標準溶液連續(xù)進樣6次，計算6次峰面積的相對標準偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相比例和提取溶劑的選擇

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版規(guī)定了32種染發(fā)劑的檢驗方法，其中對苯二胺檢驗的流動相為乙腈+磷酸鹽緩沖溶液(10+90)，試驗中以此為流動相分離兩組分，發(fā)現(xiàn)兩組分色譜峰完全重合在一起。加大水相比例以及加大乙腈比例至15%后，前者出峰時間延后，后者提前，但是兩組分仍不能有效分離。將乙腈比例調(diào)節(jié)到13%后，兩組分可以達到很好分離。實驗同時考察流速為0.8 mL/min、1.0 mL/min時的分離效果，發(fā)現(xiàn)流速為0.8 mL/min時不能很好分離，而1.0 mL/min分離效果較好。

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版規(guī)定染發(fā)劑的提取溶劑為無水乙醇+水(1+1)，試驗考察了乙醇比例為50%、70%、100%，加入相同濃度的對照品，發(fā)現(xiàn)隨者乙醇比例的提高，對苯二胺的峰面積變化不大，而羥乙基對苯二胺硫酸鹽的峰面積減小，分析是因為鹽類在含水量大的溶劑中更容易溶解，故采用50%乙醇水溶液為提取溶劑。

2.2 線性關(guān)系及檢出濃度

在8～400 μg/mL范圍內(nèi)，該方法得到的兩種染發(fā)劑的回歸方程均呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.9998；樣品取樣量為0.2 g，稀釋至10 mL，最低檢出濃度羥乙基對苯二胺硫酸鹽為10 μg/g，對苯二胺為8 μg/g，色譜圖見圖1。

圖1 羥乙基對苯二胺硫酸鹽和對苯二胺色譜圖Fig.1 Chromatograms of hydroxyethyl-p-phenylenediamineand p-phenylenediaminev

2.3 精密度試驗

濃度為40 μg/mL的混合標準溶液連續(xù)進樣6次，計算6次峰面積的相對標準偏差，兩種染發(fā)劑的峰面積標準偏差分別為1.3%、0.8%，均小于2.5%，精密度良好，結(jié)果見表1。

表1 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和精密度Table 1 Linearity rang、linear equation、correlation coefficient、detection limit and precision

2.4 加樣回收試驗

表2 不同基質(zhì)的樣品在低、中、高濃度的加標回收Table 2 Rate of recocery with different base material simple at low,middle and high concentrations

取兩種不同基質(zhì)的樣品(液體狀和乳膏狀)進行加標回收試驗。稱取樣品0.2 g，分別按照低(20 μg/mL)、中(100 μg/mL)、高(200 μg/mL)三種濃度加入對照品溶液。按樣品處理方法處理，計算回收率。兩組分不同基質(zhì)的低、中、高回收率均在83%～116%之間(表2)。

2.5 樣品分析

按照上述方法對市場上5批液體狀、乳膏狀染發(fā)劑進行檢測，結(jié)果表明，含有羥乙基對苯二胺檢出1批次，對苯二胺檢出2批次。

2.6 實驗的不足

雖然此次試驗將兩種物質(zhì)有效的分離，但是出峰時間為 4 min左右，出峰時間較早，容易受溶劑峰和雜質(zhì)峰影響，這是本試驗未解決的問題。

3 結(jié) 論

本文建立的高效液相色譜方法，以乙腈+磷酸鹽緩沖溶液(13+87)為流動相，檢測波長為280 nm，操作簡便，回收率和重現(xiàn)性較好，可以有效地分離羥乙基對苯二胺硫酸鹽和對苯二胺，同時建立了染發(fā)劑中羥乙基對苯二胺硫酸鹽的檢驗方法。