黃蓓蓓，王永志

(1.河南科技大學(xué) 應(yīng)用工程學(xué)院 食品工程系， 河南 三門峽 472000；2.三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品園林學(xué)院，河南 三門峽 472000)

1 概述

香菇[Lentinulaedodes(Berk.)Pegler]，隸屬于多孔菌科(Polyporaceae)、香菇屬(Lentinula)[1]。香菇的肉質(zhì)鮮美、味道獨特，具有較高的食用和藥用價值。目前香菇鮮品、干品、醬料已經(jīng)成為人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢扇鄙俚呐腼冇昧蟍2-4]。我國是較早進(jìn)行香菇人工栽培的國家[5]。香菇的營養(yǎng)豐富，富含多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)。除此之外，香菇還含有極高的不飽和脂肪酸、麥角甾醇、菌甾醇、香菇肽和酪氨酸氧化酶。麥角甾醇可轉(zhuǎn)化為維生素D，能增強(qiáng)人體機(jī)能；而香菇肽和酪氨酸氧化酶可起到降血壓的作用。研究表明，香菇中的活性物質(zhì)多糖能改善機(jī)體代謝、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫能力、抗衰老和抗氧化[6]。

有關(guān)香菇液體發(fā)酵的研究主要集中于對發(fā)酵培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件的優(yōu)化問題上，大多報道多以香菇菌絲體的生物量為指標(biāo)[7-13]。韓冰等通過探究香菇菌株遼香6號的最佳液體深層發(fā)酵實驗，發(fā)現(xiàn)最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基為：紅糖1%、玉米粉2%、酵母粉1%、麩皮2%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸鎂0.1%[14]。李春霞等以香菇0912號為供試菌株，探究不同養(yǎng)分和條件下對菌絲體干質(zhì)量的影響，結(jié)果表明影響香菇菌絲干質(zhì)量的因素為葡萄糖、玉米漿、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀[15-16]。

傳統(tǒng)香菇多糖的提取是從子實體中獲得的，然而香菇子實體的生長周期較長，受季節(jié)和環(huán)境的限制，其生產(chǎn)效率較低[17-19]。香菇液體發(fā)酵技術(shù)具有周期短、成本低、產(chǎn)量大、可工業(yè)化生產(chǎn)等特點[20]。目前對于香菇液體發(fā)酵條件的研究仍不夠深入，液體發(fā)酵所得的多糖產(chǎn)量普遍不高[21-23]。不同產(chǎn)區(qū)的香菇菌種，其液體發(fā)酵的條件也不盡相同[24]，本文通過對香菇液體發(fā)酵的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，同時也對發(fā)酵液中多糖提取的工藝進(jìn)行了探究，為香菇液體發(fā)酵的工廠化生產(chǎn)奠定了一定的基礎(chǔ)[25]。

2 材料與方法

2.1 實驗菌種

香菇菌株LE08為本實驗室自行分離于野生香菇子實體而得，菌株保藏于本實驗室。

2.2 實驗試劑

玉米粉、單糖、麥麩、酵母膏、多糖、硫酸鈣、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鈉和硝酸銨。

2.3 實驗儀器

培養(yǎng)箱、無菌工作臺、滅菌鍋、500 mL三角瓶、搖床、1000 mL燒杯、注射器、天平、離心機(jī)和pH計。

2.4 培養(yǎng)基

2.4.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

土豆培養(yǎng)基：土豆20 g，糖2.0 g，瓊脂1.8 g，純凈水1000 mL。

2.4.2 種子培養(yǎng)基

土豆20 g，糖2.0 g，蛋白胨1.0 g，磷酸氫二鉀0.5 g，純凈水1000 mL。

2.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖2.0 g，蛋白胨1.0 g，磷酸二氫鉀0.5 g，無菌水1000 mL。

2.5 實驗方法

2.5.1 香菇菌種活化

在超凈工作臺內(nèi)，用無菌接種鏟從香菇菌株LE08的母管斜面試管內(nèi)取1 cm3的菌塊，接種于PDA上，并在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，定時觀察菌絲的生長狀態(tài)，待菌絲長滿試管后，便可進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.5.2 搖瓶種子液和香菇發(fā)酵液的制備

在超凈工作臺中，用無菌接種鏟從已活化的菌株LE08的PDA斜面試管中鏟取6塊大小為1 cm3的菌塊，分別接種于裝有100 mL種子液體培養(yǎng)基的三角瓶中，每瓶3塊菌塊。將接種好的三角瓶放置于搖床中，溫度調(diào)整為25 ℃，轉(zhuǎn)速為160 r/min，培養(yǎng)7～10 d。

LE08菌株的液體菌種制作結(jié)束后，在無菌工作臺中，將種子液轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵的三角瓶中，裝液量共為100 mL。將接種好的三角瓶置于搖床中，溫度為25 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)至發(fā)酵終點。

2.5.3 最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽篩選

供試碳源為玉米粉、麥芽糖、葡萄糖和蔗糖；碳源篩選培養(yǎng)基：蛋白胨1.5%、碳源2.0%和磷酸二氫鉀0.06%。

供試氮源為硝酸銨、麥麩、蛋白胨和酵母膏；氮源篩選培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%、氮源1.5%和磷酸二氫鉀0.06%。

供試無機(jī)鹽為硫酸鎂、硫酸鈣、磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉；無機(jī)鹽篩選培養(yǎng)基：無機(jī)鹽0.06%、葡萄糖2.0%和蛋白胨1.5%。

按照上述配方，分別配制用于篩選碳源、氮源和無機(jī)鹽的發(fā)酵液，接種已培養(yǎng)好的香菇種子液10 mL，培養(yǎng)至發(fā)酵終點后分別測定不同碳源、氮源和無機(jī)鹽對香菇發(fā)酵液中多糖產(chǎn)量的影響。

2.5.4 正交實驗設(shè)計

本文篩選對香菇發(fā)酵液中多糖產(chǎn)量影響較大的因子：蛋白胨、葡萄糖和磷酸二氫鉀，進(jìn)行三水平三因素的正交實驗，見表1。

表1 正交實驗因素以及水平Table 1 Orthogonal experimental factors and levels

2.5.5 醇沉法提取發(fā)酵液中的多糖

按照已經(jīng)篩選出的最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽配方，配制香菇液體發(fā)酵液，方法參考2.5.2。將充分發(fā)酵的液體離心處理，取上清液，再經(jīng)0.20 μm濾膜過濾，放置于4 ℃保存，備用。

2.5.6 乙醇加入量對香菇液體發(fā)酵液中多糖提取的影響

取50 mL上述制備好的香菇發(fā)酵液于燒杯中，調(diào)節(jié)pH值為7，分別按照表2的體積比例加入無水乙醇。在室溫條件下放置24 h，離心并收集沉淀，干燥后稱重，計算香菇發(fā)酵液中的多糖含量。

表2 醇沉法提取多糖中無水乙醇的添加量Table 2 The additive amount of absolute ethanol in polysaccharide extracted by alcohol precipitation method mL

2.5.7 醇沉?xí)r間對香菇液體發(fā)酵液中多糖提取的影響

取50 mL香菇發(fā)酵液于燒杯中，調(diào)節(jié)pH值為7，添加無水乙醇150 mL。在室溫條件下，分別靜置12，24，36 h后經(jīng)離心收集沉淀，干燥、稱重、計算香菇發(fā)酵液中的多糖含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同碳源對香菇液體發(fā)酵的影響

圖1 不同碳源對香菇發(fā)酵液中多糖產(chǎn)量的影響Fig.1 The effect of different carbon sources on the yield of polysaccharides in the fermentation liquid of Lentinus edodes

本研究為考察不同碳源對香菇液體發(fā)酵的影響，選取4種碳源，分別為麥芽糖、玉米粉、蔗糖和葡萄糖，其添加濃度均為2.0%。由圖1可知，碳源的種類不同，香菇發(fā)酵液中香菇多糖產(chǎn)量也不相同。當(dāng)以葡萄糖為碳源時，香菇發(fā)酵液所產(chǎn)的香菇多糖量最高，達(dá)1.31 g/L,其次是蔗糖和麥芽糖，多糖產(chǎn)量最低的碳源為玉米粉。由此說明葡萄糖為香菇液體發(fā)酵的最適宜碳源。

3.2 不同氮源對香菇液體發(fā)酵的影響

圖2 不同氮源對香菇發(fā)酵液中多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 The effect of different nitrogen sources on the yield of polysaccharides in the fermentation liquid of Lentinus edodes

本實驗選取了4類氮源麥麩、硝酸銨、蛋白胨、酵母膏，添加濃度均為1.0%。探究在不同氮源條件下，香菇液體發(fā)酵液中多糖產(chǎn)量的變化。麥麩、蛋白胨和酵母膏為有機(jī)氮源，硝酸銨為無機(jī)氮源。由圖2可知，使用有機(jī)氮源(麥麩、蛋白胨和酵母膏)時，香菇發(fā)酵液中的多糖含量較高，其中以蛋白胨為氮源時，香菇發(fā)酵液中的多糖產(chǎn)量最高，為1.49 g/L；以硝酸銨為氮源時，香菇發(fā)酵液中的多糖產(chǎn)量僅為0.54 g/L。由此表明香菇液體發(fā)酵的最適氮源為蛋白胨。

3.3 不同無機(jī)鹽對香菇液體發(fā)酵的影響

圖3 不同無機(jī)鹽對香菇發(fā)酵液中多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 The effect of different inorganic salts on the yield of polysaccharides in the fermentation liquid of Lentinus edodes

3種無機(jī)鹽硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣的添加濃度均為0.06%。由圖3可知，以磷酸二氫鉀為無機(jī)鹽時，香菇液體發(fā)酵液中的多糖含量最高，多糖產(chǎn)量高達(dá)1.31 g/L，說明磷酸二氫鉀對香菇多糖的合成具有促進(jìn)作用。

3.4 正交實驗結(jié)果

由上述單因素實驗結(jié)果可知，適合香菇液體發(fā)酵的最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽分別為葡萄糖、蛋白胨和磷酸二氫鉀。在此條件下，按照表1進(jìn)行三因素三水平的正交實驗，結(jié)果見表3。

表3 葡萄糖、蛋白胨和磷酸二氫鉀三因素三水平的正交實驗結(jié)果Table 3 Three-factor and three-level orthogonal experimental results of glucose, peptone and monopotassium phosphate

由表3可知，A2B2C3組合的結(jié)果最好，并且蛋白胨對香菇液體發(fā)酵多糖產(chǎn)量的影響最大，磷酸二氫鉀次之，葡萄糖的影響最小。確定香菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖2%、蛋白胨1.5%、磷酸二氫鉀0.07%。在此條件下，香菇液體發(fā)酵多糖的產(chǎn)量為1.68 g/L。

3.5 無水乙醇加入量對香菇發(fā)酵液中多糖提取量的影響

圖4 乙醇的添加量對香菇發(fā)酵液中多糖提取量的影響Fig.4 The effect of ethanol additive amount on the extraction yield of polysaccharides in the fermentation liquid of Lentinus edodes

由圖4可知，當(dāng)無水乙醇的添加量小于或等于150 mL時，香菇液體發(fā)酵液中的多糖提取量隨著乙醇添加量的增大而增大；當(dāng)無水乙醇的添加量大于150 mL時，其多糖提取量隨著乙醇添加量的增大而逐漸下降。當(dāng)乙醇添加量與發(fā)酵液量的體積比為3∶1時，本文中乙醇的添加量為150 mL，發(fā)酵液量為50 mL，香菇液體發(fā)酵液中的多糖提取量最高，達(dá)1.56 g/L。

3.6 醇沉?xí)r間對香菇發(fā)酵液中多糖提取量的影響

圖5 醇沉?xí)r間對香菇發(fā)酵液中多糖提取量的影響Fig.5 The effect of alcohol precipitation time on the extraction yield of polysaccharides in the fermentation liquid of Lentinus edodes

由圖5可知，醇沉?xí)r間在24 h時，香菇菌株LE08的發(fā)酵液中多糖的提取量最高，為1.61 g/L，而醇沉?xí)r間大于24 h時，其多糖提取量并無顯著性增加，因此醇沉法中最佳醇沉?xí)r間為24 h。由于本實驗選取的時間周期較大，因此不能確定在醇沉12 h和24 h之間的多糖含量變化，后續(xù)實驗可有針對性地探究最佳的醇沉?xí)r間，以確保減少醇沉?xí)r間。

4 結(jié)論

本文初步研究了適合香菇LE08號菌株的液體發(fā)酵培養(yǎng)基以及提取發(fā)酵液中多糖成分的最佳醇沉工藝。通過單因素和正交實驗，確定了發(fā)酵液中的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是蛋白胨，最佳無機(jī)鹽是磷酸二氫鉀。最佳培養(yǎng)基制作方案為：葡萄糖2.0%、蛋白胨1.5%、磷酸二氫鉀0.07%時，此時香菇液體發(fā)酵多糖的產(chǎn)量最高。在探究醇沉法提取香菇發(fā)酵液中的多糖工藝時，確定了最佳的無水乙醇添加量為發(fā)酵液體積的3倍，醇沉?xí)r間為24 h。后續(xù)的實驗可集中于不同提取方法對香菇發(fā)酵液中多糖活性的影響，為香菇液體發(fā)酵的工廠化應(yīng)用提供了理論依據(jù)。