龔川杰，胡容，呂遠(yuǎn)平，何強(qiáng)，遲原龍

(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610065)

傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，如四川泡菜，在貯藏期間經(jīng)常出現(xiàn)“生花”現(xiàn)象。“生花”是在泡菜表面形成的生物膜，常導(dǎo)致鹽水渾濁、菜品軟爛和餿臭[1]，造成原材料浪費(fèi)和經(jīng)濟(jì)損失。已有研究表明膜璞畢赤酵母是導(dǎo)致發(fā)酵食品表面形成生物膜的主要菌株之一[2]。竹筍殼是食品加工中的下腳料，產(chǎn)量大、價(jià)值低，多廢棄[3]。竹筍殼提取物已被證實(shí)具有抑菌活性[4-6]，但其對(duì)于“生花”酵母及生物膜的抑制作用報(bào)道較少[7]。本研究以膜璞畢赤酵母為目標(biāo)菌，考察了3種竹筍殼提取物的抑菌特性和抑制生物膜特性，探討了竹筍殼對(duì)四川泡菜生花的影響。本文研究結(jié)果可為竹筍殼類天然防腐劑的開發(fā)提供基礎(chǔ)依據(jù)，為竹筍殼資源的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛竹筍：收獲于2020年5月，購于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場；膜璞畢赤酵母：分離自四川泡菜鹽鹵表面膜璞，實(shí)驗(yàn)室自存；蘆丁、福林-酚試劑、考馬斯亮藍(lán)G250、沒食子酸：購于成都市科隆化學(xué)品有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)：購于青島海博生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑：均為國產(chǎn)分析純；蘿卜、食鹽：購于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

SpectraMax M2型微孔板測讀儀 Molecular Devices儀器(上海)有限公司；Nikon Ts2型倒置顯微鏡 上海千欣儀器有限公司；Biosafer-10C型冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司；UV-1100型紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 竹筍殼提取物的制備

將新鮮的竹筍殼清洗、切塊，采用組織粉碎機(jī)打漿，經(jīng)紗布過濾后收集竹筍殼渣，再采用冷凍干燥得到竹筍殼打漿物(DJ)；取50 g竹筍殼渣加入至500 mL蒸餾水中，在40 ℃下攪拌提取2 h，過濾后收集提取液，經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后得到竹筍殼水提物(ST)，稱重并計(jì)算得率；采用無水乙醇替代水作為提取溶劑，其他提取工藝和條件同上，得到竹筍殼醇提物(CT)，上述3種提取物置于干燥器中貯藏，備用。

1.3.2 竹筍殼提取物中主要化學(xué)成分的測定

采用蒽酮比色法測定提取物中可溶性糖的含量[8]，采用考馬斯亮藍(lán)比色法測定可溶性蛋白質(zhì)的含量，采用硝酸鋁顯色法測定黃酮的含量[9-10]，采用福林酚比色法測定多酚含量。

1.3.3 竹筍殼提取物對(duì)膜璞畢赤酵母抑制作用的測定

配制濃度為2×103CFU/mL膜璞畢赤酵母菌懸液和100 mg/mL 3種竹筍殼提取物水溶液，分別取適量菌懸液和提取物水溶液至96孔板中混合均勻，使其中目標(biāo)菌濃度為103CFU/mL，且竹筍殼提取物濃度為6.25～50 mg/mL，以濃度為103CFU/mL的菌液為空白對(duì)照。在28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，通過肉眼觀察孔板中混合液是否出現(xiàn)渾濁確定3種提取物的最低抑菌濃度(MIC)。將培養(yǎng)后的提取物——目標(biāo)菌混合液涂布于YPD固體平板，在28 ℃靜置培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，則抑菌率(%)=[(對(duì)照組菌落數(shù)-處理組菌落數(shù))/對(duì)照組菌落數(shù)]×100。

分別取適量菌懸液和提取物水溶液至96孔板中混合均勻，使其中目標(biāo)菌OD值為0.15，且3種竹筍殼提取物濃度為各自MIC，以未加入提取物溶液的菌液為空白對(duì)照，測定3種提取物對(duì)目標(biāo)菌的抑菌動(dòng)力學(xué)曲線。

1.3.4 竹筍殼提取物對(duì)膜璞畢赤酵母菌生物膜的抑制和消除作用的測定

依據(jù)Perpetuini等[11]的方法測定3種提取物對(duì)目標(biāo)菌生物膜的抑制和消除作用。生物膜抑制實(shí)驗(yàn)：配制濃度為106CFU/mL膜璞畢赤酵母菌懸液和100 mg/mL 3種竹筍殼提取物水溶液，分別取適量菌懸液和提取物水溶液至96孔板中混合均勻，使其中目標(biāo)菌濃度為105CFU/mL，且3種提取物濃度為各自MIC，以未加入提取物溶液的菌液為空白對(duì)照。在28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，經(jīng)甲醇固定、結(jié)晶紫染色、無菌水洗滌、冰乙酸洗脫后，測定洗脫液于600 nm處的吸光度值。

生物膜消除實(shí)驗(yàn)：取適量菌懸液與無菌水混合使目標(biāo)菌濃度為105CFU/mL，在28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，菌液表面形成生物膜后，再加入適量提取物水溶液至菌液中混勻，使3種提取物濃度為各自MIC，以未加入提取物溶液的菌液為空白對(duì)照。再于28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，經(jīng)固定、染色、洗滌、洗脫后，測定洗脫液于600 nm處的吸光度值。生物膜抑制率或消除率(%)=[(對(duì)照組OD值-處理組OD值)/對(duì)照組OD值]×100。

利用光學(xué)倒置顯微鏡觀察生物膜抑制實(shí)驗(yàn)中竹筍殼水提物(25 mg/mL)對(duì)膜璞畢赤酵母生物膜的抑制作用，放大倍數(shù)為10×40，以未加入提取物的菌液為對(duì)照樣。

1.3.5 竹筍殼對(duì)四川泡菜“生花”的抑制實(shí)驗(yàn)

取500 g蘿卜洗凈、切分，浸漬于裝有煮沸冷卻食鹽水的4 L泡菜壇中，加入40 mL老泡菜母液并混勻，通過添加適量食鹽使泡菜鹽水的平衡鹽度為4%(W/V)，壇口加水密封后于室溫條件下存放2 d，此時(shí)泡菜已發(fā)酵成熟(pH約為3.5)。實(shí)驗(yàn)組將膜璞畢赤酵母菌懸液加入成熟泡菜中，同時(shí)加入200 g竹筍殼小塊2 cm2；對(duì)照組僅加入膜璞畢赤酵母菌懸液。兩組樣品均在室溫條件下放置14 d，比較觀察竹筍殼對(duì)四川泡菜“生花”的影響。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，顯著性水平P<0.05，應(yīng)用Origin 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種竹筍殼提取物的得率和主要化學(xué)成分

竹筍殼打漿物、水提物和醇提物的得率分別為5.71%、3.72%、4.02%。其中竹筍殼醇提物具有較高的黃酮和多酚含量，竹筍殼水提物中多酚含量最高(P<0.05)。營養(yǎng)物質(zhì)可溶性糖和可溶性蛋白在竹筍殼打漿物中分別達(dá)到了55.73 mg/g和24.52 mg/g[12]，與其余兩種提取物相比差異顯著(P<0.05)。

表1 3種竹筍殼提取物的主要化學(xué)成分Table 1 The main chemical components of three extracts from bamboo shoot shells

2.2 3種竹筍殼提取物的抑菌活性

3種竹筍殼提取物對(duì)膜璞畢赤酵母均表現(xiàn)出一定的抑制作用，見圖1。

圖1 3種提取物在不同濃度下對(duì)目標(biāo)菌的抑菌率Fig.1 The inhibition rates of the three extracts with different content against P. membranifaciens

由圖1可知，隨著提取物濃度的增加，3種提取物的抑菌作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)提取物濃度達(dá)到12.5 mg/mL及以上時(shí)，3種提取物的抑菌率均達(dá)到50%以上，其中竹筍殼醇提物的抑菌活性最強(qiáng)，其在濃度高于25 mg/mL時(shí)可以達(dá)到對(duì)目標(biāo)菌的完全抑制，3種提取物的抑菌動(dòng)力學(xué)曲線見圖2。

圖2 3種提取物對(duì)目標(biāo)菌的抑菌動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 The inhibitory kinetics curves of the three extracts against P. membranifaciens

由圖2可知，加入提取物的菌懸液OD值隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長增長較緩慢，當(dāng)培養(yǎng)48 h時(shí)OD600 nm值均低于0.8(空白組OD600 nm值約為1.6)，表明3種提取物對(duì)目標(biāo)菌有較強(qiáng)的抑制作用，其中竹筍殼醇提物的抑菌活性最強(qiáng)，這可能與其黃酮和多酚含量高有關(guān)。有研究證實(shí)100～200 mg/mL的竹筍殼醇提物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用能達(dá)到山梨酸鉀的效果[13]。也有研究得出竹筍殼提取液對(duì)泡菜中的“生花”酵母有抑制作用。

2.3 3種竹筍殼提取物的抑制生物膜活性

表2 3種竹筍殼提取物對(duì)膜璞畢赤酵母的最小抑菌濃度(MIC)及對(duì)其生物膜的抑制與消除作用Table 2 The minimum inhibitory concentration (MIC) of the three extracts from bamboo shoot shells on P. membranifaciens and their inhibition and elimination effects on its biofilm

由表2可知，竹筍殼水提物和醇提物在其MIC濃度下對(duì)生物膜形成的抑制率均達(dá)到70%以上，但其消除生物膜的效果較差(不足或接近10%)。

對(duì)照組中成熟生物膜呈致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，見圖3中B。加入濃度為25 mg/mL的竹筍殼水提物后，抑制了黏附細(xì)胞從酵母相轉(zhuǎn)變?yōu)榫z相，生物膜中的孔隙和管道系統(tǒng)被破壞，菌絲的形成明顯減少，破壞了生物膜結(jié)構(gòu)的完整性，見圖3中A。

圖3 添加25 mg/mL竹筍殼水提物處理組(A)和空白對(duì)照組(B)下膜璞畢赤酵母形成生物膜的形態(tài)觀察(10×40)Fig.3 The morphology observation of biofilm of P.membranifaciens in the treatment group with25 mg/mL aqueous extracts of bamboo shootshells (A) and blank control group (B)

綜合上述研究結(jié)果，推測竹筍殼提取物主要與目標(biāo)菌直接作用從而抑制生物膜形成，可能的作用機(jī)理有：減少體系中浮游產(chǎn)膜菌的數(shù)量；通過修飾改變表面性質(zhì)，阻礙浮游細(xì)胞的黏附和聚集；下調(diào)生物膜主要組成物質(zhì)如菌絲、多糖、蛋白質(zhì)、核酸的相關(guān)表達(dá)基因，降低生物膜形成能力。

2.4 竹筍殼對(duì)四川泡菜“生花”的影響

表3 四川泡菜發(fā)酵過程中pH和鹽度Table 3 The pH values and salt concentration of Sichuan pickles during fermentation

圖4 竹筍殼對(duì)四川泡菜“生花”的影響Fig.4 The effect of bamboo shoot shells on the “biofilm formation” of Sichuan pickles

由表3和圖4可知，乳酸菌在發(fā)酵前2 d快速生長產(chǎn)生乳酸，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的pH分別降至3.50和3.24，表明泡菜成熟。對(duì)照組在發(fā)酵至14 d的過程中，以膜璞畢赤酵母為主的微生物形成白色碎花狀生物膜，膜璞逐漸褶皺變厚，泡菜水渾濁，pH升高至4.16，泡蘿卜特有的酸香風(fēng)味減弱。加入竹筍殼的四川泡菜中未出現(xiàn)生花現(xiàn)象，泡菜水清亮，泡菜酸香風(fēng)味濃郁，表明竹筍殼的加入可有效抑制四川泡菜生花。此外，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組鹽濃度由初始的4%逐步降低至3.64%和3.48%，這可能與泡菜中的有機(jī)質(zhì)被分解，組織液滲透進(jìn)鹽水中有關(guān)。

3 結(jié)論

竹筍殼水提物和醇提物對(duì)膜璞畢赤酵母具有一定的抑制作用。在最小抑菌濃度下，竹筍殼水提物和醇提物可以有效抑制膜璞畢赤酵母形成生物膜，抑制率分別達(dá)到(81.76±1.31)%和(71.31±1.56)%，但這兩種提取物對(duì)目標(biāo)菌生物膜的消除作用較弱。本研究提出了一種利用竹筍加工副產(chǎn)物制備天然防腐劑的方法，可為其他農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的再利用和傳統(tǒng)發(fā)酵食品和調(diào)味品的防腐保質(zhì)提供參考。