班秋艷，潘宇婷，潘 鋮，胡 欣，李葉云，江昌俊

(1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河南 鄭州 450000；3 陜西蒼山秦茶集團(tuán)有限公司，陜西 西安 710002)

中國西南地區(qū)是茶樹(Camelliasinensis(L)O.Kuntze)的起源中心[1-2]。茶樹作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，目前在50多個國家廣泛種植[3-4]。中國茶樹種質(zhì)資源豐富，具有較高的遺傳多樣性，在漫長的歷史發(fā)展過程中，茶樹種質(zhì)資源經(jīng)自然演化和人工創(chuàng)造形成一種重要的自然資源，蘊(yùn)藏著各種性狀的遺傳基因[1]。茶樹遺傳多樣性是生物多樣性的一個重要組成部分，對某些地區(qū)瀕危物種遺傳多樣性和結(jié)構(gòu)遺傳的研究,將有助于加深對其進(jìn)化及適應(yīng)潛力的認(rèn)識，并有助于最佳保護(hù)策略的確定[5]。

種質(zhì)資源的科學(xué)鑒定和評價(jià)是優(yōu)異資源發(fā)掘和利用的前提，國內(nèi)外學(xué)者從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生化和分子水平進(jìn)行了大量研究[6]。茶樹是自交不育、高度異質(zhì)化的一類作物，利用形態(tài)和生理生化特征來描述茶樹的表型性狀，是農(nóng)藝性狀鑒定的重要依據(jù)，這對茶樹品種的鑒定具有很高的參考價(jià)值。但表型性狀易受環(huán)境的影響，出現(xiàn)連續(xù)性變異或高度的可塑性，不能充分體現(xiàn)品種間和品種內(nèi)的多態(tài)性[7]。近年來，各種DNA分子標(biāo)記被應(yīng)用于茶樹資源的遺傳多樣性、鑒定和分類研究[8-9],如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、簡單序列重復(fù)(SSR)和啟動密碼子靶向標(biāo)記(SCoT)等,為評估茶樹資源的遺傳多樣性和遺傳關(guān)系提供了很好的信息途徑[10-12]。迄今為止，簡單序列重復(fù)標(biāo)記因其共顯性遺傳、多等位基因性、高基因組豐度、基因組覆蓋范圍廣等特點(diǎn),在茶樹中得到了廣泛的應(yīng)用[13]。

陜西茶區(qū)是我國北方茶區(qū)之一，有著悠久的茶葉種植歷史。其北屏秦嶺、南倚巴山，境內(nèi)氣候終年溫和濕潤、雨量充沛，長期的自然演化和人工選擇造就了豐富的能適應(yīng)北亞熱帶和暖溫帶生境條件的灌木、中小葉型茶樹資源，是我國重要的茶樹種質(zhì)資源基因庫[2]。在1981-1984年陜西的茶樹資源調(diào)查中，程良斌[14]將陜西省茶樹種質(zhì)資源分為7大類。李劍等[15]利用石蠟制片技術(shù)評價(jià)陜西茶樹品種的抗寒性，觀察到其具有葉片較小, 柵欄組織層數(shù)多、厚度大, 柵欄組織與海綿組織比值及上表皮與海綿組織比值較高的特點(diǎn)。Zhang等[16]和陳熙[17]利用分子標(biāo)記技術(shù)分析了陜西秦巴地區(qū)的茶葉資源，發(fā)現(xiàn)它們具有高度多態(tài)性的特點(diǎn)。陜西省茶樹栽培品種以地方群體種為主[14]，省級無性茶樹品種只有陜茶1號。由于陜西茶區(qū)地形復(fù)雜，交通不便，相比于我國南方茶區(qū)，茶樹資源的研究不夠系統(tǒng)和深入，致使陜西茶樹種質(zhì)資源沒有得到充分利用。雖然陜西在茶樹種質(zhì)資源考察、鑒定評價(jià)等方面取得了一定的研究進(jìn)展，但陜西省茶樹種質(zhì)資源在分子水平上的遺傳進(jìn)化關(guān)系尚未得到充分研究利用。因此，探索陜西省茶樹資源的遺傳多樣性具有重要意義。

在新時期，任何企業(yè)與單位的發(fā)展都離不開人才的支持?，F(xiàn)代社會之下，所需求的是具備知識與實(shí)踐相結(jié)合的技術(shù)型人才，不僅要具備專業(yè)的技術(shù)能力，還需要具備優(yōu)良的個人素質(zhì)。從行政事業(yè)單位的角度來看，關(guān)鍵崗位的人才配備工作成為了重點(diǎn)，所以在財(cái)務(wù)人員的培養(yǎng)與素質(zhì)提升工作當(dāng)中，可以從多個角度進(jìn)行改進(jìn)與優(yōu)化。不僅要針對在崗人員的素質(zhì)進(jìn)行管理，定期組織相關(guān)活動進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)溝通；另一方面，按照企業(yè)內(nèi)部的發(fā)展規(guī)劃與實(shí)際需求，展開后備人才培訓(xùn)工作，重點(diǎn)對剛?cè)肼毜膯T工展開合理培訓(xùn)，輔以合理的激勵措施，提升隊(duì)伍建設(shè)水平。

筆者前期調(diào)查了陜南茶區(qū)漢中、安康兩市10個地點(diǎn)的88種不同形態(tài)的茶樹資源，并分別從形態(tài)和生化成分兩方面鑒定了陜西省茶樹資源的多樣性[18-19]。然而，形態(tài)和生化標(biāo)記常常受到地理環(huán)境的影響，因此本研究利用表達(dá)序列標(biāo)簽簡單序列重復(fù)(EST-SSR)分子標(biāo)記對陜西省茶樹資源的遺傳多樣性和遺傳分化進(jìn)行分析，以期為江北茶區(qū)茶樹資源的利用和新品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源及處理

供試茶樹資源共118份，其中88份資源來自陜西省，30份資源來自湖北、安徽、湖南、四川、廣西、貴州和云南等地，樣品詳細(xì)信息見表1。新鮮植物葉片采摘后立即用硅膠干燥于-80 ℃下儲存。

表1 供試茶樹材料的名稱及原產(chǎn)地信息Table 1 Name and origins of tested tea resources

表1(續(xù)) Continued table 1

《德國刑事訴訟法典》將“通訊監(jiān)聽”與“扣押”、“搜查”并列規(guī)定于同一章節(jié)[5]，并且將“通訊監(jiān)聽”視作與“扣押”、“搜查”同等性質(zhì)的偵查措施。在德國，監(jiān)聽實(shí)行法官令狀主義，并且針對不同情形的監(jiān)聽分別規(guī)定了不同的適用條件，但是，《德國刑事訴訟法典》并未對偶然監(jiān)聽所得材料的證據(jù)能力作出規(guī)定。對于合法監(jiān)聽時偶然獲得的另案證據(jù)是否予以排除，德國學(xué)說和實(shí)務(wù)主要存在以下四種不同見解[6]：

1.2 EST-SSR標(biāo)記與PCR擴(kuò)增

改善系統(tǒng)頻率穩(wěn)定性的多直流功率緊急支援協(xié)調(diào)控制策略//許濤,吳雪蓮,李兆偉,張劍云,郄朝輝,劉明松,等//(22):69

利用Powermarker V3.25軟件對陜西省茶樹的EST-SSR序列信息進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果表明，陜西省茶樹的MAF為0.348 6，基因型為17.116 3個，Na為7.139 5，Ho為0.818 2。陜西省茶樹具有高度多樣性，其H值和PIC值分別為0.750 4和0.716 7。

1.3 數(shù)據(jù)分析

圖2表明，陜西省88份茶樹種質(zhì)資源可分為A、B、C共3組。其中A組包含3份茶樹資源，分別為紫陽縣城關(guān)鎮(zhèn)青中村的7號材料、西鄉(xiāng)縣大河鎮(zhèn)石馬村的41號材料和鎮(zhèn)巴縣興隆鎮(zhèn)大河村的63號材料。B組包含6份材料，分別為紫陽縣麻柳鎮(zhèn)染房村的14、38、68號材料，西鄉(xiāng)縣大河鎮(zhèn)石馬村的24號材料，紫陽縣城關(guān)鎮(zhèn)青中村的32號材料和寧強(qiáng)縣青木川鎮(zhèn)玉泉壩村的20號材料。C組類群較大，故根據(jù)遺傳距離將C組分為9個亞組(C1-C9)，包括除鎮(zhèn)巴縣興隆鎮(zhèn)大河村外的9個地點(diǎn)的79份材料。其中C1類群包含23份材料，7份來自紫陽縣城關(guān)鎮(zhèn)青中村的材料聚在一起；C2類群包含5份材料，其中2份來自鎮(zhèn)巴縣興隆鎮(zhèn)青獅村；C3類群包含6份材料，其中3份來自紫陽縣麻柳鎮(zhèn)染房村；C4類群包含2份材料，均來自紫陽縣麻柳鎮(zhèn)染房村；C5類群包含11份材料，其中5份來自紫陽縣麻柳鎮(zhèn)染房村，3份來自西鄉(xiāng)縣大河鎮(zhèn)石馬村；C6類群包含22份材料，其中8份來自紫陽縣麻柳鎮(zhèn)染房村，5份來自寧強(qiáng)縣青木川鎮(zhèn)玉泉壩村，4份來自紫陽縣城關(guān)鎮(zhèn)青中村，4份來自西鄉(xiāng)縣大河鎮(zhèn)石馬村；C7類群包含3份材料，2份來自西鄉(xiāng)縣大河鎮(zhèn)石馬村；C8類群包含4份材料，2份來自寧強(qiáng)縣青木川鎮(zhèn)玉泉壩村；C9類群包含3份材料。

用陳熙[17]、Freeman等[20]、姜燕華[21]公布的105對EST-SSR引物對茶樹材料進(jìn)行擴(kuò)增，對其多態(tài)性和退火溫度進(jìn)行確定和篩選，從中選取擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性豐富的43對引物，引物合成由上海生工生物有限公司完成。參考Liu等[13]的方法，PCR擴(kuò)增體系(20 μL)為：模板DNA(約50 ng/μL)2 μL，10×PCR緩沖液2 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.2 μL，引物(10 μmol/L)0.5 μL，Taq聚合酶0.5 μL,ddH2O補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性50 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增的SSR片段在96通道毛細(xì)管電泳全自動核酸分析儀(Fragment AnalyzerTM96)上進(jìn)行分離。試劑為雙鏈DNA試劑盒DNF-900(Advanced Analytical Technologies，Inc.)，包括FA-dsDNA凝膠、5×930 dsDNA緩沖液、1×TE稀釋緩沖液、插層染料、標(biāo)記物、DNA Marker(分別為35，75，100，150，200，250，300，400和500 bp)、5×毛細(xì)管調(diào)節(jié)液、毛細(xì)管儲存溶液和礦物油。根據(jù)DNA濃度，用1×TE稀釋液稀釋PCR產(chǎn)物約10倍。將2 μL PCR產(chǎn)物和18 μL 1×TE混合液加入到96孔板中，在96孔板的D12和H12位置加入24 μL DNA Marker，以分離出35～500 bp的擴(kuò)增片段，辨析不同等位基因之間1 bp的差異。將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并使用PROSize 2.0軟件校準(zhǔn)。選擇清晰、亮度高的條帶進(jìn)行后續(xù)分析。

利用Powermarker V3.25軟件和原始數(shù)據(jù)，計(jì)算物種水平和群體水平的主等位基因頻率(major allele frequency,MAF)、基因型(genotype)、等位基因數(shù)Na(observed number of alleles)、觀測雜合度Ho(observed heterozygosity,)、Nei基因多樣性指數(shù)H(Nei’s genetic diversity index,)、多態(tài)信息含量PIC(polymorphic information content)和Nei’s遺傳距離[23-24]?；贜ei’s遺傳距離，利用MEGA 6軟件進(jìn)行UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean)聚類，并繪制聚類圖[25]。

SSR多態(tài)信息含量的計(jì)算公式為：

式中：Pi表示第i個等位位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率。當(dāng)PIC≥0.5時，該基因座為高度多態(tài)性；0.25≤PIC<0.5 時，為中度多態(tài)性；當(dāng)PIC<0.25時，為低度多態(tài)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹EST-SSR標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性分析

用43對EST-SSR引物在118份茶樹材料中共檢測到310個等位基因和832個基因型。各標(biāo)記的MAF在0.150 4～0.865 9，平均為0.336 8。每個位點(diǎn)的等位基因數(shù)為2～14個，平均為7.21個；擴(kuò)增的基因型為3～57個，平均為19.35個。43對SSR位點(diǎn)的PIC值在0.205 3～0.904 2，平均為0.727 2，表明我國茶樹具有較高的遺傳多樣性。這些微衛(wèi)星位點(diǎn)在所有樣品中均有良好的擴(kuò)增。遺傳多樣性分析結(jié)果表明，H在0.232 3～0.911 0，平均為0.760 0；Ho在0.105 7～0.991 8，平均為0.811 2(表2)。其中引物A168在部分材料中擴(kuò)增的EST-SSR條帶見圖1。

表2 43對EST-SSR引物序列信息及在118份茶樹材料中的遺傳信息Table 2 Sequence information of 43 EST-SSR primers and genetic information in 118 tea plants

表2(續(xù)) Continued table 2

“老師，您喜歡梔子花嗎？！我們這里梔子花很常見，以為您這個城里來的老師看不上呢！所以大家都不敢送給您，怕您嫌棄。既然您喜歡，那我們天天給您送，送最大朵、最香的……”

A1-H12代表樣本在96孔板的位置A1-H12 represents the position of the sample on the 96 well plate圖1 用A168引物從部分茶樹材料中分離出的EST-SSR條帶Fig.1 Segregation of EST-SSR bands amplified with primers A168 from partial tea materials

2.2 88份陜西茶樹資源的親緣關(guān)系分析

根據(jù)電泳結(jié)果，利用PROSize 2.0軟件統(tǒng)計(jì)目的片段范圍內(nèi)清晰且重復(fù)的條帶，同時結(jié)合人工讀帶，根據(jù)分子質(zhì)量的大小，從大到小依次記作A、B、C、D、E……，一條帶為純合，兩條帶為雜合，分別記錄，如AA、AB、BC、BD、DE、EE等，不同的引物因等位基因的位置而異，獲得原始數(shù)據(jù)，建立矩陣[22]。

1～88代表種質(zhì)編號,且與表1相同1-88 represents the germplasm number,the same as Table 1

2.3 8個省份茶樹資源的系統(tǒng)進(jìn)化分析

有學(xué)者說：“猶太人之所以是猶太人，就是因?yàn)樗麄兇砹瞬粩鄰?qiáng)調(diào)自己‘差異’的他者；猶太教之所以是猶太教，就是因?yàn)樗鼜膩聿灰阅骋惶囟ǖ募兇庑问酱嬖凇！雹倨鋵?shí)，《摩西五經(jīng)》文本中的重復(fù)和重復(fù)中的差異，甚至矛盾，是因?yàn)槲谋臼嵌嗳嗽诓煌瑫r間、不同時代書寫造成的，是由于實(shí)際記錄者多人、多次敘述，記錄的年代不一樣，各種學(xué)科當(dāng)時也沒有分開，甚至于都沒有出現(xiàn)，所記述的事物便會有重復(fù)、自相矛盾的混亂。

根據(jù)共有等位基因的遺傳距離，對源自8個省(自治區(qū))的118份茶樹資源進(jìn)行聚類分析。由于陜西省茶樹材料數(shù)量多，在很大程度上會影響聚類結(jié)果，故本研究中陜西省的材料以村莊為單位，其他以省份為單位進(jìn)行聚類，結(jié)果見圖3。聚類結(jié)果表明，當(dāng)遺傳距離為0.05時，陜西省的茶樹材料聚為一支，說明陜西省茶樹群體具有較高的相似遺傳信息，為一個相對獨(dú)立的資源庫；所有茶樹材料可以分為6組，其中湖南、安徽和四川3省聚為一組，其余各地各為一組，分別為云南、陜西、湖北、貴州和廣西。陜西與湖北兩省材料的遺傳距離較近。

圖3 基于UPGMA的118份茶樹資源聚類圖Fig.3 Cluster dendrogram of 118 tea resources based on UPGMA method

3 討 論

3.1 茶樹EST-SSR的多態(tài)性

隨著分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、基因組學(xué)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記的種類也越來越豐富，除了傳統(tǒng)的RAPD、AFLP、RFLP、簡單重復(fù)序列區(qū)間(ISSR)、EST-SSR外，近年來又出現(xiàn)了序列標(biāo)記位點(diǎn)(STS)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、SCoT等分子標(biāo)記。茶樹作為異花授粉的多倍體木本植物，基因組相對比較復(fù)雜，隨著茶樹基因組測序的完成[4,26]，基因組SSR也逐漸被開發(fā)[13,27]。本研究中43對EST-SSR引物各項(xiàng)數(shù)據(jù)均處于理想范圍，在118份供試茶樹材料中具有高度多態(tài)性。本研究中茶樹材料平均等位基因數(shù)(7.21個)低于Liu等[13]和Shen等[5]報(bào)道的基因組SSR(14.9個)和RAPD(9.6個)。PIC值(0.727 2)與Freeman等[20]報(bào)道的微衛(wèi)星平均PIC值(0.748)相當(dāng)，低于Liu等[13]報(bào)道的G-SSR的平均PIC值。由于EST-SSR較為保守，故比基因組G-SSR檢測到的多態(tài)性低。這與早期的研究結(jié)果一致，這些研究表明，在山茶屬植物中，基因組SSR標(biāo)記的多態(tài)性具有更高水平[28]。然而，本研究中平均等位基因數(shù)高于早期對EST-SSR的研究結(jié)果[10,28-29]。這種等位基因數(shù)量的差異取決于分離和檢測SSR片段的方法差異。本研究選擇高分辨率的96通道毛細(xì)管電泳全自動核酸分析儀，以取代瓊脂糖和丙烯酰胺凝膠來分析茶樹SSR，這對提高等位基因多態(tài)性有顯著貢獻(xiàn)；同時也降低了試劑成本，提高了靈敏度和效率，更為重要的是，毛細(xì)管電泳提高了實(shí)驗(yàn)人員的安全保障[13,17]。目前，毛細(xì)管電泳在茶樹研究中也得到了一定的應(yīng)用[13,17,30]。

采用BIOMIGA公司植物基因組DNA提取試劑盒提取茶樹基因組DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳(電泳條件：1×TAE緩沖液；1.2%瓊脂糖凝膠；110 V電壓，25 min)檢測DNA的純度和完整性；利用核酸定量儀檢測DNA濃度和OD260/OD280值。根據(jù)所測的DNA濃度，用ddH2O將DNA樣品稀釋到約50 ng/μL，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 陜西省典型茶樹群體的遺傳多樣性

“陜茶1號”是陜西省唯一通過國家品種登記的茶樹品種，與陜西豐富的茶樹種質(zhì)資源實(shí)際不符，這主要是由于人力和交通的限制，很多資源未能得到很好地挖掘。隨著人們對種質(zhì)資源的認(rèn)識不斷深入，分析手段逐漸更新優(yōu)化，陜西茶樹資源正逐步受到重視并被加以研究利用。從本研究結(jié)果來看，陜西省茶樹基因遺傳多樣性H為0.750 4，高于福建、浙江、臺灣等地[29]；也高于Yao等[10]研究中中國450個茶樹品種的基因多樣性(0.64)。另外，陜西茶樹資源的PIC值也高于福建、浙江、臺灣等省的茶樹資源，以及用61個EST-SSR標(biāo)記測定的印度茶樹資源的PIC值(0.497)[28]。本研究結(jié)果為陜西省茶樹遺傳多樣性的評價(jià)奠定了理論基礎(chǔ)，有利于茶樹資源進(jìn)一步的開發(fā)利用。

3.3 陜西省茶樹資源的評價(jià)

陜西茶樹資源的歷史可以追溯到唐代。陜西茶樹資源位處于江北茶區(qū)，遠(yuǎn)離茶樹起源地云貴地區(qū)[18-19]。此前有關(guān)陜西茶樹資源的研究，僅涉及極少數(shù)陜西茶樹資源，且使用的DNA標(biāo)記相對較少，對陜西茶樹資源的認(rèn)識不夠全面。前期本課題組通過資源調(diào)查，并利用表型性狀評價(jià)，得到不同性狀的88份茶樹資源材料[18-19]。本研究對以上88份陜西茶樹資源進(jìn)行聚類分析顯示，同一地區(qū)來源的茶樹資源多聚類在一起，不同地區(qū)的茶樹資源也有聚在一起的情況，說明收集的88 份陜西省茶樹資源具有相似的遺傳背景，這些資源具有相似的起源或經(jīng)過了更多的遺傳交流。但安康市紫陽縣城關(guān)鎮(zhèn)青中村的7號材料與漢中市城固縣董家營鎮(zhèn)胥家營村的17號材料遺傳距離較遠(yuǎn)；且7和17號材料的茶葉特征性生化成分有較大區(qū)別[19]；這2個材料遺傳背景差異較大，具有較強(qiáng)的育種潛力。地域聚類分析結(jié)果表明，安康市茶樹資源與漢中市茶樹資源是相互傳播的。陜西省所有材料聚類在一起，表明陜西省茶樹資源擁有相對獨(dú)立的遺傳背景。陜西省和湖北省兩地的茶樹資源具有比較親密的遺傳關(guān)系，在今后的育種工作中，需要加強(qiáng)陜西茶樹資源與外省優(yōu)良茶樹資源的基因交流，以創(chuàng)制新的材料。

定義3 設(shè)T={Tk=k:k=1,,n}，其中Tk為得分變量，n為正整數(shù)，則稱T為離散得分集。假定Tk越大其所對應(yīng)的主體排序越靠前或越優(yōu)。

4 結(jié) 論

用43對高質(zhì)量EST-SSR標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，陜西省茶樹資源遺傳多樣性較高，并具有相對獨(dú)立的遺傳背景。陜西和湖北兩地茶樹資源的遺傳關(guān)系較為親密，茶樹育種從業(yè)者可以利用遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)的茶樹進(jìn)行雜交，以獲得優(yōu)良性狀的雜交后代。