李倩倩，趙福杰，丁慶文，張云飛，鄭蘭蘭,2

(1 河南農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，河南 鄭州 450002；2 河南省動物性食品安全重點實驗室，河南 鄭州 450002)

豬薩佩羅病毒(porcine sapelovirus，PSV)是球形、無囊膜、直徑約30 nm的單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科，薩佩羅病毒屬[1]。PSV全基因組大小約為7.5 kb，含有一個開放閱讀框，編碼4個結構蛋白(VP1～VP4)和7個非結構蛋白(2A～2C,3A～3D)[2]。由于PSV最初是從腹瀉豬的腸道中分離得到，故曾命名為豬腸道病毒(porcine enterovirus，PEV)8型，屬于PEVⅡ群[3]。PSV只有一種血清型，可感染家豬和野豬[4]，引起豬腹瀉、肺炎、繁殖障礙、腦脊髓炎等多系統(tǒng)綜合征，同時也可表現(xiàn)為無明顯癥狀的亞臨床感染[5]，若不加以防控，會給養(yǎng)豬業(yè)帶來較大的威脅[6]。PSV的發(fā)現(xiàn)最早可追溯到20世紀60年代的英國[7]，之后在中國、西班牙、巴西、韓國[5,8-10]等國家被相繼報道，在世界范圍內分布廣泛。Lan等[5]對中國華東地區(qū)2009-2010年收集的960份豬糞便樣本進行流行病學調查，結果發(fā)現(xiàn)，PSV感染的陽性率為17.2%，且10～20周齡的豬感染率最高。Cano-Gómez等[8]對來自西班牙的63份豬腹瀉樣品進行檢測，PSV的陽性率為6.4%，而且發(fā)現(xiàn)該病毒與豬捷申病毒等病原存在混合感染現(xiàn)象。Son等[10]對100份豬腹瀉病料進行檢測，PSV的感染率高達34%，但是單獨感染PSV的陽性率僅為5.9%。

目前，針對PSV的檢測方法主要有病毒分離與鑒定[5]、RT-PCR[2]和間接免疫熒光[11]方法等，這些方法在臨床檢測中發(fā)揮了重要作用。但這些檢測方法相對費時，且敏感性較差，不適宜進行PSV早期感染的診斷，并且這些方法均不能對宿主體內病毒含量進行準確定量，因此建立一種快速、可定量、靈敏的檢測方法對PSV的臨床診斷是非常必要的。本研究建立了PSVTaqMan 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測方法，并對該方法的敏感性、特異性、重復性以及臨床應用效果進行了驗證，以期為PSV的早期診治提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 毒株和臨床檢測樣品 豬薩佩羅病毒、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、豬δ冠狀病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，均由河南省動物性食品安全重點實驗室鑒定并保存。臨床病料83份，為2018-2019年在河南不同地區(qū)豬場收集到的樣本，其中糞便樣品39份(河南省周口市22份，平頂山市7份，許昌市4份，開封市4份，新鄉(xiāng)市2份)，腸道樣品44份(剖檢自腹瀉仔豬，南陽市17份，漯河市7份，鶴壁市5份，新鄉(xiāng)市4份，開封市4份，周口市4份，平頂山市3份)。

1.1.2 試劑及儀器 核酸純化柱(RNA專用)，購自索萊寶生物科技有限公司；反轉錄試劑盒、質粒提取試劑盒，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；BM 2000+DNA Marker，購自北京博邁德生物技術有限公司；DNA凝膠回收試劑盒，購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司； Premix ExTaqTM、pMD-18T載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，購自寶生物工程(大連)有限公司；CFX96實時熒光定量PCR儀，購自Bio-Rad公司(美國)。

1.1.3 引物和探針的設計與合成 從GenBank下載PSV的全基因序列，選擇其保守的5′UTR設計2對特異引物F1/R1和F2/R2及探針P(表1)，引物和探針由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，探針P的5′端標記FAM熒光報告基團，3′端標記TAMRA-N熒光淬滅基團。

表1 引物與探針信息Table 1 Information of primers and probe

1.2 核酸提取及反轉錄

將病毒樣品和臨床樣品經(jīng)無菌處理后，參照TRIzol總RNA提取說明書提取PSV、TGEV、PDCoV、PEDV和PRRSV等的總RNA，利用Vazyme反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，-20 ℃保存。

1.3 陽性質粒標準品的制備

以PSV cDNA為模板進行PCR擴增，并設以ddH2O代替模板的處理作為陰性對照。PCR反應體系為：2×RapidTaqMaster Mix 13 μL，ddH2O 9 μL，F(xiàn)1和R1引物各0.5 μL，模板2 μL。PCR反應程序為：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，使用V-ELUTE Gel Mini Purification Kit 回收目的片段，將目的片段連接到 pMD-18T載體上，將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)氨芐抗性的固體LB平板培養(yǎng)基篩選后挑取疑似單一菌落，擴大培養(yǎng)，送菌液到武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進行測序鑒定。提取陽性重組質粒，測定濃度之后計算拷貝數(shù)，用去離子水將重組質粒稀釋成(3.88×100)～(3.88×109) 拷貝/μL的溶液，作為模板標準品，用于標準曲線的繪制。

1.4 PSV TaqMan RT-qPCR檢測方法的建立

1.4.1 熒光定量PCR反應體系和條件的優(yōu)化 以3.88×105拷貝/μL的標準質粒為模板，進行TaqMan RT-qPCR反應，反應總體系為25 μL：Premix ExTaqTM12.5 μL,模板cDNA 3 μL，10 μmol/L 引物F2、R2各0.25，0.4，0.5，0.75或1.0 μL，5 μmol/L探針P 0.5，0.8，1.0，1.5或2.0 μL，其余用ddH2O補齊。依據(jù)引物和探針的退火溫度分別在56，58，60，62 ℃退火進行反應。對比不同條件下的反應結果，確定最終反應體系與反應條件。

1.4.2 標準曲線的建立 選取(3.88×102)～(3.88×108) 拷貝/μL的標準質粒作為模板，同時設置陰性對照(以ddH2O代替模板)，采用1.4.1節(jié)優(yōu)化的反應體系與反應條件進行RT-qPCR擴增，以讀取的循環(huán)閾值(Ct)為y軸，以標準質粒含量(拷貝/μL)的常用對數(shù)值為x軸，繪制Ct與質粒含量的標準曲線。

1.4.3 敏感性試驗 分別用(3.88×100)～(3.88×109) 拷貝/μL的質粒作為模板，采用1.4.1節(jié)優(yōu)化的反應體系與反應條件進行試驗，測定該方法敏感性。同時進行普通PCR敏感性測定。

1.4.4 特異性試驗 按照1.4.1節(jié)建立的反應體系，分別以PEDV、PDCoV、TGEV和PRRSV核酸為模板，同時設3.88×105拷貝/μL的標準質粒為陽性對照，ddH2O代替模板處理為陰性對照，進行TaqMan RT-qPCR擴增，重復2次，檢驗該方法的特異性。

1.4.5 重復性試驗 分別選取3.88×102，3.88×105，3.88×108拷貝/μL的標準質粒作為模板，進行3次批內與批間TaqMan RT-qPCR反應，根據(jù)每次試驗的Ct值計算變異系數(shù)，驗證該方法的重復性。

1.5 臨床樣品的檢測

應用本研究建立的TaqMan RT-qPCR方法，對2018-2019年收集自河南部分地區(qū)豬場的83份樣品進行檢測，同時進行普通PCR檢測，驗證該方法的臨床應用效果。

2 結果與分析

2.1 PSV TaqMan RT-qPCR反應體系和條件的優(yōu)化

經(jīng)過對引物、探針用量和退火溫度的優(yōu)化，最終確定RT-qPCR反應體系如下：Premix ExTaqTM12.5 μL，引物F2和R2各0.5 μL，探針P 1 μL，cDNA模板3 μL，去離子水7.5 μL。最佳反應條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。

2.2 PSV TaqMan RT-qPCR標準曲線的建立

Ct值(y)與標準質粒含量(拷貝/μL)的常用對數(shù)值(x)的回歸方程為y=-3.515x+41.808，相關系數(shù)R2為0.998(圖1)，表明Ct值與倍比稀釋的標準質粒之間具有良好的線性關系。

圖1 PSV TaqMan RT-qPCR標準曲線Fig.1 Standard curve of PSV TaqMan RT-qPCR

2.3 PSV TaqMan RT-qPCR檢測方法的敏感性

用建立的TaqMan RT-qPCR方法對(3.88×100)～(3.88×109) 拷貝/μL的標準質粒進行試驗。結果顯示,該方法對標準質粒的檢測下限為3.88×101拷貝/μL(圖2)，而普通PCR的檢測下限為3.88×103拷貝/μL(圖3)。結果表明，TaqMan RT-qPCR的敏感性是普通PCR的100倍。

1～9.分別為(3.88×109)～(3.88×101) 拷貝/μL標準質粒的擴增結果1-9.Amplification of standard plasmids (3.88×109)-(3.88×101) copies/μL

M.DNA Maker BM 2000+；1～9.依次為(3.88×109)～(3.88×101) 拷貝/μL標準質粒的擴增結果；10.陰性對照M.DNA Maker BM 2000+;1-9.Amplification of standard plasmids (3.88×109)-(3.88×101) copies/μL;10.Negative control

2.4 PSV TaqMan RT-qPCR檢測方法的特異性

特異性試驗結果(圖4)表明，除陽性對照之外，PEDV、PDCoV、TGEV和PRRSV的擴增結果均呈陰性，說明該方法能夠檢測出PSV，而不與其他病毒(PEDV、PDCoV、TGEV和PRRSV)出現(xiàn)交叉反應，具有良好的特異性。

圖4 PSV TaqMan RT-qPCR檢測方法的特異性試驗(以TGEV為例)Fig.4 Specificity test of PSV TaqMan RT-qPCR method (TGEV as example)

2.5 PSV TaqMan RT-qPCR檢測方法的重復性

分別以3.88×102，3.88×105，3.88×108拷貝/μL的標準質粒作為模板進行重復性試驗，結果顯示批內與批間Ct值的變異系數(shù)均小于1.0%(表2)，表明該方法的重復性較好。

表2 PSV TaqMan RT-qPCR檢測方法的重復性Table 2 Reproducibility test of PSV TaqMan RT-qPCR method

2.6 臨床樣品檢測

PSVTaqMan RT-qPCR方法對83份臨床樣本的檢測結果顯示，PSV陽性樣品有31份，檢出率為37.3%(31/83)，其中糞便陽性樣品22份， PSV含量為(2.1×103)～(8.5×104) 拷貝/μL；腸道陽性樣品9份， PSV含量為(3.7×102)～(8.7×103) 拷貝/μL。普通PCR方法檢測呈陽性的樣品有10份(糞便陽性樣品7份，腸道陽性樣品3份)，檢出率為12.0%(10/83)，檢出率明顯低于TaqMan RT-qPCR方法。普通PCR檢測呈陽性的樣品，TaqMan RT-qPCR方法檢測也均呈陽性。隨機選取3份TaqMan RT-qPCR方法陽性而普通PCR方法檢測陰性的樣本進行測序鑒定，結果呈PSV陽性，表明本研究建立的方法檢出率高，準確性好，可用于PSV的臨床流行病學調查。

3 討 論

PSV主要感染家豬和野豬，對任何年齡段的豬均有感染性，特別是斷奶仔豬更易受到該病毒的感染[12-13]，是引起豬腸炎、肺炎、腦脊髓灰質炎和繁殖障礙等癥狀的重要病原體[14]。近年來，PSV在豬群中的感染呈上升趨勢，且易與豬瘟病毒、豬細小病毒、豬捷申病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒等發(fā)生混合感染[15-16]，造成感染豬出現(xiàn)嚴重的臨床癥狀，康復豬持續(xù)帶毒，懷孕母豬流產或產死胎，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[17]。

PSV的檢測方法有病毒分離鑒定[18]、普通RT-PCR[2]、熒光定量PCR[17,19]、環(huán)介導擴增等溫[20]和ELISA[21]等技術。病毒分離是傳統(tǒng)的鑒定方法之一[22-23]，Lan等[5]分離了中國第一株豬薩佩羅病毒，并通過電鏡觀察到病毒的外部結構，但是該方法耗時長、需要無菌環(huán)境，對臨床快速診斷有一定局限性；普通PCR可應用于大量樣本的檢測，檢測成本較低，但不能對病原進行定量檢測，且不適用于病毒的早期診斷。環(huán)介導擴增等溫技術是一種新興的基因擴增技術，采用恒溫在較短時間就可實現(xiàn)核酸擴增，并且無需后續(xù)的核酸凝膠電泳等過程，簡化了試驗過程，避免了可能出現(xiàn)的操作污染的發(fā)生[24]。ELISA方法利用抗原抗體特異性結合的特點對病毒進行檢測，但是抗體制備花費時間較長，因此也不能及時有效地用于臨床診斷。

實時熒光定量PCR方法是基于SYBR Green Ⅱ和探針法的一種檢測方法,目前被廣泛應用于病原的早期檢測及流行病學調查[25],由于其靈敏度較高，特異性較強，而且能夠定量檢測樣品中的核酸含量，成為目前在臨床檢測上最準確的方法之一[26]。TaqMan探針法既實現(xiàn)了PCR對核酸的高效擴增，規(guī)避了普通PCR技術因核酸含量低造成的漏檢，又具有特異性強和靈敏性高的優(yōu)點[27]。郭博等[17]建立的PSV SYBR GreenⅡ實時熒光定量PCR檢測方法，檢測下限為6.37×102拷貝/μL，而本研究建立的TaqMan RT-qPCR檢測方法檢測下限為3.88×101拷貝/μL,相較于前者來說，靈敏度更高。

郭博等[17]采用SYBR GreenⅡ實時熒光定量PCR檢測方法對四川省部分地區(qū)的58份豬腹瀉糞便進行檢測，陽性率為56.9%。孫杰等[21]采用ELISA方法對2016年采自江蘇省6個不同地區(qū)豬場的281份臨床血清樣品進行了檢測，PSV抗體陽性率為38.43%。本研究對83份臨床樣品進行PSV檢測，結果顯示，陽性率為37.3%(31/83)，說明PSV在中國的豬場已經(jīng)普遍存在，需要引起重視。

本研究建立的PSVTaqMan實時熒光定量PCR方法，對PSV的流行病學調查提供了技術支撐，有利于我國豬群中PSV的監(jiān)測和防控。