黃 天,張曉彤,趙江琳,郭健銘,周 鑫,徐 勇

(南京林業(yè)大學 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心;化學工程學院,江蘇 南京210037)

低聚木糖(XOS),又稱木寡糖,是一類由2～7個木糖單元通過糖苷鍵連接而成的功能性糖,它具有比其他功能性寡糖更強的益生菌增殖能力,國際益生菌和益生元科學協(xié)會于2017年明確了低聚木糖是有益于宿主健康的“超強益生元”[1]。目前,低聚木糖已被廣泛應用于食品、飼料和醫(yī)藥保健等領域,尤其在功能性食品和飼料中的應用十分普遍[2]。低聚木糖的制備方法主要為含木聚糖原料的酶水解和酸水解,其中酶水解法反應條件溫和且具有選擇性,但反應周期長、成本高,相比之下,酸水解法工藝簡單、生產(chǎn)周期短,因此更適合低聚木糖的規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)[3]。其中無機酸與有機酸均可用于水解木聚糖制備低聚木糖,但無機酸通常為強酸,容易使木聚糖過度水解,造成木糖和糠醛等副產(chǎn)物大量累積,且無機酸更易腐蝕設備[4-6]。有機酸由于活化能較低,具有更高的選擇性,能夠實現(xiàn)目標產(chǎn)物的可控生產(chǎn)[7],其中如乙酸、馬來酸和草酸等有機酸,均被報道可用于制備低聚木糖[8-10]。然而,酸法生產(chǎn)低聚木糖的主要缺陷在于酸水解木聚糖原料生成低聚木糖的同時會伴有大量的副產(chǎn)品木糖產(chǎn)生,因此,為提高低聚木糖產(chǎn)品純度通常需要通過物理或生物法將木糖脫除[11-12]。本課題組前期研究[13]表明利用氧化葡萄糖酸桿菌生物氧化作用可將木糖轉化為木糖酸,木糖酸是一種溫和無毒的水溶性有機酸,可以用于輔助水解木聚糖原料生產(chǎn)低聚木糖。為了探討木糖酸輔助水解木聚糖原料生產(chǎn)高純度低聚木糖的可行性,本研究首先通過響應面法(RSM)對木糖酸質量分數(shù)、反應溫度和水解時間進行優(yōu)化以獲得最優(yōu)的低聚木糖得率,同時聯(lián)合使用氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵與電滲析分離技術實現(xiàn)副產(chǎn)品木糖制備木糖酸,以及木糖酸與低聚木糖的分離,以期為建立一條基于可回收木糖酸的生產(chǎn)高純度低聚木糖的工藝路線提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米芯堿抽提木聚糖(純度70%),江蘇康維生物有限公司;木糖標準品、酵母粉,上海Sigma-Aldrich公司;木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖標準品,Megazyme公司;木糖酸溶液(質量分數(shù)20%)由南京林業(yè)大學生物化工研究所自制。其余試劑均為市售分析純。

斜面培養(yǎng)基:酵母粉5 g/L、山梨醇50 g/L、瓊脂20 g/L?；罨囵B(yǎng)基:酵母粉5 g/L、山梨醇50 g/L。增殖培養(yǎng)基為:酵母粉10 g/L、山梨醇100 g/L[14]。氧化葡萄糖酸桿菌(ATCC 621H),由美國ATCC提供,在-4℃下保存在斜面培養(yǎng)基上。

內外循環(huán)恒溫數(shù)顯不銹鋼油浴鍋;高效陰離子交換色譜ICS-3000(配備CarboPacTMPA200色譜柱和PAD檢測器)、Ledend Mach 1.6R型冷凍離心機,美國賽默飛公司;自制電滲析裝置,配有聚苯醚雙極膜(膜面積90×210 mm2),山東天維膜技術有限公司;Agilent1260型高效液相色譜(HPLC),配備Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱及RID示差折光檢測器,美國安捷倫科技公司;Spectrumlab 752s型紫外可見分光光度(UV-Vis)計,上海棱光技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1木聚糖酸水解將1.5 g木聚糖粉加入30 mL不銹鋼管式反應器中,按固液比1∶10(g∶mL)加入15 mL木糖酸溶液,混合并潤脹1 h,隨后將密封罐體置于設定溫度的油浴中反應,反應結束后將罐體置于冷水浴中迅速降溫,待冷卻后打開反應器將樣品轉移至50 mL離心管中,在10 000 r/min離心5 min。收集上清液并分析低聚木糖(XOS)及副產(chǎn)物的含量,離心剩余固體渣廢棄。

1.2.2響應面試驗優(yōu)化選取木糖酸質量分數(shù)(2%、4%、8%、12%和16%)、反應溫度(110、130、150、170和190℃)、反應時間(5、20、35、50和65 min)做單因素試驗分別考察這3個因素對XOS得率的影響。在單因素試驗的基礎上,以反應溫度(X1)、木糖酸質量分數(shù)(X2)和反應時間(X3)為自變量,每個因素設置3個水平數(shù),以XOS得率(Y)作為評價指標,通過Design-Expert(版本11.0)軟件,采用Box-Behnken設計響應面試驗,建立響應值與影響因素間的數(shù)學模型,以預測木糖酸水解木聚糖制備XOS的最佳條件。

1.2.3氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵水解液 將氧化葡萄糖酸桿菌菌種接入載有50 mL活化培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,在150 r/min、30℃下活化培養(yǎng)16 h;在5 000 r/min下對活化后的種子培養(yǎng)液離心5 min收集菌體,然后在超凈工作臺中將菌體接入裝有250 mL增殖培養(yǎng)基的1 L錐形瓶中,在220 r/min、30℃下增殖培養(yǎng)20 h;在5 000 r/min條件下對增殖培養(yǎng)的菌液離心5 min后收集菌體。發(fā)酵選取在最優(yōu)木糖酸水解低聚木糖的條件下制備的酸水解液原液(即包含XOS、木糖與木糖酸的混合液)50 mL裝入250 mL的錐形瓶中,發(fā)酵前使用50%的氫氧化鈉調節(jié)水解液原液的pH值至6.5,隨后接入4 g/L的氧化葡萄糖酸桿菌細胞在220 r/min、30℃發(fā)酵12 h,發(fā)酵過程中采用50%NaOH調節(jié)pH值在5～7。

1.2.4電滲析分離發(fā)酵后的水解液(主要包含木糖酸鈉與XOS)電滲析過程具體可見圖1。在電極室中添加0.3 mol/L的硫酸鈉溶液以提高電導率并降低膜疊層的電阻,在自制的電滲析裝置中,額定電壓60 V、電流10 A、電流密度50 mA/cm2下試驗30 min。首先,通過泵將鹽室中的發(fā)酵液直接泵入雙極膜電滲析裝置中,木糖酸根離子(XA-)通過陰離子交換膜運輸?shù)剿崾?并與電解產(chǎn)生的H+結合后轉化為木糖酸(XA-H),同時在堿室中形成NaOH,最后含有XOS的水溶液可以保留在鹽室中[15]。

圖1 發(fā)酵水解液電滲析過程圖Fig.1 Diagram of electrodialysis process of fermentation hydrolysate

1.3 分析方法

1.3.1木聚糖含量測定木聚糖的含量采用美國可再生能源實驗室(NREL)標準方法測定[16]。

1.3.2色譜分析采用高效陰離子交換色譜測定XOS、木糖和木糖酸的含量,以100 mmol/L的NaOH與500 mmol/L的醋酸鈉作為流動相進行二元梯度洗脫,流速為0.3 mL/min,柱溫為30℃[17]。以木糖酸、木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖的標準品作為外標分別測定樣品中各組分的含量。木糖、XOS和木糖酸的得率按照以下公式計算。

式中:yX—木糖得率,%;yXOS—低聚木糖得率,%;yXAH—木糖酸得率,%;m0—初始原料中木聚糖的總質量,g;m1—水解液中木糖的總質量,g;m2—水解液中木二糖至木六糖質量總和,g;m3—發(fā)酵液中新增木糖酸的質量,g;1.1—木糖至木糖酸的轉化系數(shù)。

2 結果與分析

2.1 木聚糖酸水解單因素試驗

前期研究[18]表明反應溫度、酸濃度和水解時間是影響木聚糖水解的3個關鍵性因素,因此,首先分別探討了這3個工藝條件對木糖酸水解木聚糖制備低聚木糖的影響,主要結果如圖2所示?？梢姷途勰咎堑牡寐试谝欢l件范圍內(反應溫度＜150℃、木糖酸質量分數(shù)＜8%、反應時間＜35 min)會隨著條件的增強而提高;然而,隨著反應條件的繼續(xù)增強,低聚木糖會發(fā)生進一步水解,導致副產(chǎn)物木糖的大量生成。因此,綜合考慮確定以反應溫度130、150和170℃,木糖酸質量分數(shù)4%、8%和12%,反應時間10、35和60 min用于響應面分析。

圖2 反應條件對木聚糖降解的影響Fig.2 Effect of reaction conditions on xylan degradation

2.2 木聚糖酸水解的響應面試驗

2.2.1響應面試驗設計及結果在單因素試驗的基礎上,確定3因素3水平的試驗組合,共運行15組試驗,試驗設計及結果見表1,方差分析見表2。

表1 響應面分析的結果Table 1 Results of response surface analysis

表2 響應面統(tǒng)計的方差分析Table 2 ANOVA for response surface model

由表2方差分析可知,一次項X1與二次項的P值小于0.05,表明其對低聚木糖得率影響顯著,的P值均小于0.01,表明對低聚木糖得率影響極顯著,根據(jù)P值大小判斷各因素對低聚木糖得率的影響大小為:反應溫度＞木糖酸質量分數(shù)＞反應時間。而交互項X2X3的P值小于0.05,表明其對低聚木糖得率影響顯著,X1X2、X1X3的P值均小于0.01,表明對低聚木糖得率具有極顯著影響。各項因素對低聚木糖得率影響經(jīng)回歸擬合后得到的二次多項回歸模型:該模型的F值為51.12(P＜0.01),表明方程達到極顯著。此外,該響應面的分析決定系數(shù)R2值為0.936 3,在預期范圍,表明預測模型擬合性良好,且呈現(xiàn)合理的線性相關性;校正決定系數(shù)為0.974 1,進一步說明模型擬合度良好。因此,該模型可用于對木糖酸輔助水解木聚糖制備低聚木糖進行分析和預測。

2.2.2響應曲面圖與等高線圖分析3個交互項X1X2、X1X3和X2X3均存在顯著的交互作用,其三維響應曲面的等高線呈橢圓狀,表示任意2因素中某一因素(條件)的改變會影響到另一因素(條件)的選取。此外,如圖3所示,在保證低聚木糖得率的情況,高反應溫度和短反應時間的組合更適于木聚糖的水解,且效率更高。

圖3 兩因素交互作用對低聚木糖得率的影響Fig.3 Effects of interaction of any two factors on the yield of xylooligosaccharides

2.2.3優(yōu)化與驗證實驗利用Design-Expert 11.0軟件,從回歸模型中求得木糖酸輔助水解木聚糖的最優(yōu)條件為反應溫度170℃、木糖酸質量分數(shù)5.942%、反應時間22.124 min,在此條件下模型預估的低聚木糖得率為55.7%。為便于實際操作,將參數(shù)修正為170℃、6.0%、22 min,并據(jù)此進行驗證實驗。在此條件下,水解物中的木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖的質量濃度分別為18.5、10.9、8.9、7.7、5.6和5.3 g/L,其中低聚木糖(木二糖～木六糖)總質量濃度為38.4 g/L,對應低聚木糖得率為54.9%,即實際測定結果值與理論值相差0.8個百分點(＜5%),該結果與預測值無明顯統(tǒng)計學差異,表明上述響應面模型設計合理,且具有一定的指導意義。

2.3 木糖酸水解液的發(fā)酵與分離

2.3.1木糖發(fā)酵在最優(yōu)條件下進行木聚糖的木糖酸輔助降解,可獲得包含有質量分數(shù)1.85%木糖,3.8%低聚木糖與6%木糖酸的多組分混合水解液。為進一步提升低聚木糖產(chǎn)品質量,首先以氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵木糖生產(chǎn)木糖酸,原水解液的各組分在細胞催化反應中的變化如圖4所示,發(fā)酵12 h,18.5 g/L木糖被發(fā)酵為18.2 g/L的木糖酸(木糖酸的增量為1.8%),木糖利用率91.6%,木糖酸得率為90.9%,累積木糖酸總質量分數(shù)由初始6%提升至7.8%。此外,由圖4可以看出木糖僅被發(fā)酵為木糖酸而沒有進一步分解代謝,且各低聚木糖組分在發(fā)酵過程中也未能被氧化葡萄糖酸桿菌利用,低聚木糖總的質量濃度依然為38.4 g/L。綜上所述,經(jīng)過氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵,原水解液變?yōu)橐再|量分數(shù)7.8%木糖酸與3.8%低聚木糖為主的混合液。

2.3.2電滲析分離經(jīng)過氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵后,木糖酸水解液中主要成分為低聚木糖(質量分數(shù)3.8%)與木糖酸(質量分數(shù)7.8%),其中有效成分低聚木糖(聚合度2～6)約占干基成分的30%(干燥后測定)。Liu等[11]研究表明:通過雙極膜電滲析法可以有效實現(xiàn)水解液中組分的分離與同步回收,得到有機酸和低聚木糖。因此,為了進一步提高低聚木糖成分的有效占比,通過電滲析對發(fā)酵過的水解液中的低聚木糖和木糖酸進行分離和回收試驗。試驗結果表明發(fā)酵液中近95%的木糖酸被分離并在酸室中回收,98%的低聚木糖仍然被保留水解液中。經(jīng)發(fā)酵與電滲析后的水解液中殘余的木糖酸與低聚木糖質量濃度分別為3.91和37.6 g/L,即通過電滲析處理后,干燥處理,其低聚木糖(木二糖～木六糖)組分均占干基總質量的75%。

3 結 論

3.1以低聚木糖得率作為評價指標,在單因素試驗的基礎上進行了響應面優(yōu)化,得到木糖酸輔助水解木聚糖制備低聚木糖的最佳條件為:反應溫度170℃,木糖酸質量分數(shù)6%,反應時間22 min,該條件所獲得的低聚木糖的得率為54.9%。

3.2氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵和雙極膜電滲析分離實現(xiàn)了木聚糖酸水解液中副產(chǎn)物木糖的有效轉化以及木糖酸與低聚木糖的分離回收,其中木糖轉化率為91.6%,木糖酸回收率為95%,低聚木糖純度由30%提高到75%。