田姝琪，汪耘吉，譚 孟，李春華，祝玉祥，閆彩鳳，馮尚勇

(1.揚州大學(xué)附屬蘇北人民醫(yī)院 a.內(nèi)分泌代謝科；b.普外科，江蘇 揚州 225001；2.大連醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116044)

流行病學(xué)表明，高達65%的普通人群可超聲檢出甲狀腺結(jié)節(jié)(thyroid nodule, TN)，其中惡性結(jié)節(jié)占10%，甲狀腺超聲是評估其良惡性的基本方法[1]。2017年美國放射學(xué)會(American College of Radiology，ACR)提出采取積分制將TN分為ACR-TIRADS(ACR Thyroid Imaging, Reporting and Data System) 1～5類，該方法較以往的TIRADS分類標(biāo)準(zhǔn)更為細(xì)致客觀，得到了臨床醫(yī)生的廣泛認(rèn)可。ACR-TIRADS4類TN的惡性風(fēng)險在5%～20%之間，需要進一步評估其病理性質(zhì)后制定其治療方案[2]。超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查(ultrasound-guided fine needle aspiration cytology, UG-FNAC)是國內(nèi)外指南均推薦的鑒別TN良惡性的主要方法。目前普遍采用Bethesda分類標(biāo)準(zhǔn)進行細(xì)胞學(xué)診斷，采用液基薄層細(xì)胞學(xué)技術(shù)(thinprep cytologic test, TCT)處理穿刺標(biāo)本明顯減少了紅細(xì)胞的干擾[3]。然而，UG-FNAC受到操作者經(jīng)驗、病例選擇、結(jié)果判讀等影響，仍有20%～30%的結(jié)節(jié)無法確定良惡性[1, 4]。研究表明，鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1V600E (BRAFV600E)基因突變對甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)具有高度的特異性，是診斷PTC的主要分子標(biāo)志物，但其敏感性相對較低。目前針對UG-FNAC聯(lián)合BRAFV600E基因突變對ACR-TIRADS4類結(jié)節(jié)的診斷價值的研究尚缺乏相關(guān)資料。

1 資料與方法

1.1病例選擇 2018年1月至2021年6月在揚州大學(xué)附屬蘇北人民醫(yī)院經(jīng)超聲檢查評估為ACR-TIRADS 4類的TN，進一步行UG-FNAC和BRAFV600E突變檢測并行手術(shù)治療患者471例，男性110例，女性361例，年齡17～78歲，平均(44.2±9.8) 歲，以術(shù)后病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：具有完整的臨床資料、甲狀腺功能及抗體檢查、超聲檢查、UG-FNAC細(xì)胞學(xué)病理結(jié)果、BRAFV600E報告和術(shù)后組織學(xué)病理報告。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往甲狀腺手術(shù)史、頸部放射治療史及資料不完整的患者。本研究經(jīng)揚州大學(xué)附屬蘇北人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者分別在醫(yī)生告知情況后簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1甲狀腺功能及抗體測定 采集患者清晨空腹外周靜脈血，應(yīng)用德國羅氏全自動發(fā)光分析儀(Cobase601)進行測定，促甲狀腺素(thyroid stimulating hormone, TSH)、游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine, FT3)、游離甲狀腺素(free thyroxine, FT4)、甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody, TPOAb)、甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibody, TGAb)。參考值范圍分別為：0.27～4.2 mIU/L, 3.1～6.8 pmol/L, 12～22 pmol/L, 0～115 IU/L, 0～34 IU/L。

1.2.2甲狀腺超聲檢查 由相對固定的高年資超聲科醫(yī)師對患者頸部進行超聲檢查，并文字記錄TN的影像學(xué)特征后存儲TN病灶的具體圖像。使用2017版ACR-TIRADS報告評分系統(tǒng)，對TN進行分類，如果無法分類或超聲評估醫(yī)生存在分歧，由2位副高級職稱醫(yī)生會診后評分為最終分類。根據(jù)縱橫比大于1、實性結(jié)節(jié)、低回聲、點狀強回聲、邊緣不規(guī)則五個可疑特征的數(shù)目，將超聲評估為TIRADS4類的結(jié)節(jié)分為4a類(1個)、4b類(2個)和4c(3～4個)3個亞類[5]。

1.2.3UG-FNAC檢查 經(jīng)知情同意后，由固定的醫(yī)生在超聲引導(dǎo)下對ACR-TIRADS4類TN進行穿刺，將穿刺的針頭在盛有10 ml BD CytoRich Red 固定液的離心管內(nèi)涮洗，將針管內(nèi)的標(biāo)本全部轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)并做好標(biāo)記送檢病理科。本研究UG-FNAC細(xì)胞學(xué)穿刺結(jié)果參照2017版甲狀腺細(xì)胞病理學(xué)Bethesda報告系統(tǒng)推薦的分類標(biāo)準(zhǔn)，將結(jié)果分為6類，將Ⅰ～Ⅳ類定義為良性組，Ⅴ類和Ⅵ類定義為惡性組。

1.2.4BRAFV600E基因檢測 將穿刺所得的樣本進行DNA提取(廈門艾德生物醫(yī)藥公司核酸提取試劑)，應(yīng)用紫外分光光度計測定DNA濃度，其OD260/OD280在1.8～2.0之間，應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)法檢測BRAFV600E突變(擴增方法：ADx-ARMS方法；儀器：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司StepOnePlus Thermal Cycler；擴增試劑：廈門艾德生物公司的人類BRAFV600E突變檢測試劑盒)。若突變檢測管的FAM信號擴增呈S型曲線且Ct值<30，則為突變型；若樣品的FAM信號擴增曲線不呈S型曲線或Ct值≥30，則為野生型。診斷標(biāo)準(zhǔn)：突變型診斷歸為惡性組，野生型診斷歸為良性組。

2 結(jié) 果

2.1臨床資料及術(shù)后病理類型 本研究共納入TN患者471例，以術(shù)后組織病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)分為良性組和惡性組。惡性組298例，均為PTC；良性結(jié)節(jié)173例，其中結(jié)節(jié)性甲狀腺腫106例，甲狀腺腺瘤47例，橋本甲狀腺炎7例，肉芽腫性炎10例，局部纖維增生3例。臨床資料分析表明：兩組性別、結(jié)節(jié)直徑、FT3、FT4、TPOAb、TGAb差異無統(tǒng)計學(xué)意義, 但年齡和TSH差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。超聲特點分析表明：兩組之間的結(jié)節(jié)回聲性質(zhì)、鈣化類型分布、縱橫比>1、形態(tài)及血供分布特點均存在顯著差異(P<0.05)。見表2。兩組的 UG-FNAC和BRAFV600E突變檢測的結(jié)果分布均存在顯著差異(P<0.05)。見表3，BRAFV600E突變檢測陽性與陰性情況，見圖1，2。

表1 兩組臨床資料比較

表2 兩組結(jié)節(jié)超聲特征比較[例(%)]

表3 兩組UG-FNAC和BRAFV600E突變檢測診斷分布比較[個(%)]

圖1 BRAFV600E突變陽性

圖2 BRAFV600E突變陰性

2.2不同檢查方法對TIRADS4類結(jié)節(jié)的診斷效能 UG-FNAC聯(lián)合BRAFV600E突變檢測診斷ACR-TIRADS4類結(jié)節(jié)的Se和NPV分別為95.6%和92.9%，優(yōu)于UG-FNAC(75.8%、70.4%)和BRAFV600E突變檢測(56.7%、57.0%)。計算AUC評估診斷效能，UG-FNAC聯(lián)合BRAFV600E突變檢測(0.970)對ACR-TIRADS 4類結(jié)節(jié)的診斷效能優(yōu)于單獨UG-FNAC(0.873)或BRAFV600E突變(0.778)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表4。UG-FNAC聯(lián)合BRAFV600E突變檢測診斷TIRADS4a、4b、4c類結(jié)節(jié)的PPV、NPV、Se、Sp詳見表5，AUC分別為0.961(95%CI：0.925～0.996)、0.972(95%CI：0.946～0.972)、0.981(95%CI：0.956～1.000)。

表4 不同診斷方法對ACR-TIRADS4類結(jié)節(jié)的診斷價值

表5 UG-FNAC聯(lián)合BRAFV600E突變檢測對ACR-TIRADS4類不同亞分類結(jié)節(jié)的診斷價值

3 討 論

本研究471例TI-RADS4類結(jié)節(jié)中惡性結(jié)節(jié)占63.27%(298/471)，遠(yuǎn)高于美國指南中的惡性風(fēng)險，與我國指南推薦相似，其原因可能與研究人群選擇相關(guān)。惡性結(jié)節(jié)組的超聲檢查多呈低回聲、鈣化、縱橫比>1、形態(tài)不規(guī)則，但血供分布缺乏特征性改變，與之前指南推薦及回顧性研究相符，鈣化類型以點狀鈣化最多見(154/298)，血供分布以混合血管型最多、中央血供為主型次之、邊緣血管型最少。

TN是臨床常見病，檢出率隨超聲檢查的普及而增加，大部分為良性結(jié)節(jié)，惡性甲狀腺結(jié)節(jié)以PTC多見，TIRADS4類結(jié)節(jié)惡性風(fēng)險頗具爭議[6]。471例ACR-TIRADS4類結(jié)節(jié)中，女性與男性之比為3.28∶1(361/110)，良性組與惡性組性別比例分別為3.12∶1和3.38∶1；惡性組結(jié)節(jié)的患病年齡低于良性組，平均年齡(42.2±10.8)歲，與Miao等[7]研究結(jié)果相似。在健康人群中篩查甲狀腺超聲造成的過度診斷增加了甲狀腺癌的發(fā)病率，其中以PTC增加更顯著，年輕人群可能更重視自身健康而提前了甲狀腺癌的發(fā)現(xiàn)時間，可能還與目前環(huán)境內(nèi)分泌干擾物、工作節(jié)奏加快等因素相關(guān)[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)惡性組TSH水平高于良性組(P<0.05)。血清TSH水平升高可能通過誘導(dǎo)與甲狀腺癌不良預(yù)后相關(guān)的通路發(fā)生轉(zhuǎn)化而增加分化性甲狀腺癌的侵襲性[9]。

超聲檢查是評估TN惡性風(fēng)險的最佳影像學(xué)檢查手段，具有無創(chuàng)、簡便、便于長期隨訪等優(yōu)勢，但易受到操作者經(jīng)驗的影響，2017年美國放射學(xué)會參照乳腺影像報告與數(shù)據(jù)系統(tǒng)的制定方法發(fā)表《ACR甲狀腺影像報告與數(shù)據(jù)系統(tǒng)白皮書》，采取積分制將結(jié)節(jié)分為ACR-TIRADS 1～5類，研究發(fā)現(xiàn)，從TIRADS 1～5類，惡性腫瘤的風(fēng)險呈顯著上升趨勢，TIRADS4類結(jié)節(jié)的風(fēng)險閾值評估為5%～20%之間，中華醫(yī)學(xué)會制定的2020中國TN超聲惡性危險分層指南即C-TIRADS中指出TI-RADS4類結(jié)節(jié)的惡性風(fēng)險在2%～90%之間[2, 6]。因TI-RADS4類結(jié)節(jié)惡性風(fēng)險不確定性高，對診斷干擾較大，有必要進一步完善檢查。

UG-FNAC是評估TN有效、經(jīng)濟檢查方法，影響著TN的治療決策，直徑大于10 mm或侵犯頸部臨近血管、神經(jīng)等解剖結(jié)構(gòu)的TIRADS4類結(jié)節(jié)更建議綜合考慮風(fēng)險與獲益后積極獲取細(xì)胞學(xué)病理[6]。相較于常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片檢查，TCT技術(shù)更好地保存細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，在UG-FNAC中廣泛應(yīng)用。本研究中UG-FNAC診斷4類結(jié)節(jié)的PPV和Sp在98%以上，但Se、NPV不足80%，與廖麗燕等[10]研究結(jié)果相似，鄭斌等[11]研究則發(fā)現(xiàn)PPV、NPV、Sp和Se均可在90%以上，考慮與使用的超聲診斷分層方法差異有關(guān)，本研究與廖麗燕等[10]研究均采用ACR制定的TIRADS標(biāo)準(zhǔn)，鄭斌等[11]則是采用基于ACR的改良版TIRADS標(biāo)準(zhǔn)。由于受到穿刺結(jié)節(jié)的大小、質(zhì)地、鈣化、鈣化形式以及操作者經(jīng)驗和細(xì)胞病理學(xué)家的影響，有20%～30%不能通過細(xì)針穿刺活檢明確為良性或惡性[12]。本研究中Bethesda Ⅰ類和Ⅲ類結(jié)節(jié)占總穿刺標(biāo)本的22.08%(104/471)，良性組和惡性組中Bethesda Ⅰ類和Ⅲ類結(jié)節(jié)在本組穿刺標(biāo)本中占比分別為23.12%(40/173)和21.48%(64/298)。

血清學(xué)標(biāo)記物(如血清胸苷激酶1、甲狀腺球蛋白、甲狀腺轉(zhuǎn)移因子1)、分子標(biāo)記物(如BRAFV600E突變、RAS突變、RET/PTC重排)與甲狀腺惡性結(jié)節(jié)相關(guān)[13]。BRAF是MAPK信號通路的關(guān)鍵促進因子，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡中起重要作用，BRAFV600E突變是分化型甲狀腺癌尤其是PTC所特有的分子標(biāo)記物，與PTC出現(xiàn)多灶性、淋巴結(jié)和甲狀腺外轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等不良預(yù)后相關(guān)。既往研究顯示，PTC中BRAFV600E突變的敏感性較低且與地區(qū)種族相關(guān)，高碘攝入的韓國超過80%，西方國家不足10%，中國人群突變率可達80%[14, 15]。本研究惡性組中BRAFV600E基因檢測為野生型者占43.29%(129/298)，約半數(shù)的惡性結(jié)節(jié)仍可能被漏診。本研究中BRAFV600E突變檢測診斷TN的PPV和Sp在95%以上，但NPV和Se不足60%，容易造成較高的漏診率。

由此可見，單獨應(yīng)用UG-FNAC和BRAFV600E均會造成較高的漏診率。多項針對UG-FNAC細(xì)胞學(xué)不確定結(jié)節(jié)的研究表明，BRAFV600E突變檢測聯(lián)合UG-FNAC，可顯著提高診斷敏感性，并保持良好的特異性，盡管在FNA標(biāo)本中存在假陰性或假陽性的BRAFV600E突變，并不影響對TN總體的輔助診斷效能，聯(lián)合應(yīng)用仍可提高對惡性腫瘤的預(yù)測效能[16]。；韓英等[17]發(fā)現(xiàn)Bethesda系統(tǒng)聯(lián)合BRAFV600E檢測可使TN診斷的Se由不足70%提高到87.8%，NPV由60%左右提高到79.7%，Sp、PPV保持90%以上。本研究中UG-FNAC聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測的Se、NPV由不足80%分別提高到95.6%和92.9%，并保持非常好的Sp、PPV，充分保留了敏感度、陰性預(yù)測值與特異度、陽性預(yù)測值的互補作用。超聲評估的TIRADS4類結(jié)節(jié)的惡性風(fēng)險范圍隨分級的增高而增加，4c類結(jié)節(jié)惡性風(fēng)險范圍最大(21%～91.9%)[5]。譚興利等[18]研究UG-FNAC診斷4a、4b、4c類結(jié)節(jié)的Sp在90%左右，但Se僅80%左右。本研究UG-FNAC聯(lián)合BRAFV600E突變檢測診斷TIRADS4a、4b、4c的敏感度和特異度均在90%以上，計算AUC分別為0.961、0.972和0.981，對存在1項及以上可疑超聲特征的4類結(jié)節(jié)同時行細(xì)胞病理學(xué)檢查和BRAFV600E突變基因檢測可提高診斷效能。

綜上所述，TIRADS4類結(jié)節(jié)的惡性風(fēng)險跨度大，采用TCT處理UG-FNAC標(biāo)本聯(lián)合BRAFV600E突變檢測對ACR-TIRADS4類的不同亞類結(jié)節(jié)均具有較高診斷準(zhǔn)確率，能夠有效地指導(dǎo)臨床醫(yī)生做出合理的治療方案，減少漏診和誤診。