王 卉, 陳 曼

(河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河北 三河 065201)

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)是臨床上檢測(cè)急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)微小殘留病(minimal residual disease, MRD)常用的技術(shù)之一，具有靈敏度高、覆蓋率廣等優(yōu)點(diǎn)，已被用于復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)和指導(dǎo)治療方法選擇[1-4]。但FCM檢測(cè)AML MRD仍存在諸多難點(diǎn)和問題，如白血病細(xì)胞的復(fù)雜性、多樣性、抗原漂移以及技術(shù)因素等[5-8]。本文結(jié)合國(guó)內(nèi)外FCM檢測(cè)AML MRD現(xiàn)狀，提出解決上述問題對(duì)策、介紹新技術(shù)及臨床實(shí)用性，有助于提高檢測(cè)水平，促進(jìn)FCM技術(shù)檢測(cè)AML MRD臨床應(yīng)用。

1 FCM檢測(cè)AML MRD現(xiàn)狀及問題

FCM檢測(cè)AML MRD經(jīng)歷20多年發(fā)展：①雖然儀器分類為4～20色，但是目前常用流式細(xì)胞儀為8～10色，建議做8色及以上方案[9-10]；全光譜流式儀器在少數(shù)醫(yī)院開始應(yīng)用并初見成效；②建議使用白血病相關(guān)免疫表型(leukemia-associated immunophenotypes, LAIP)與正常表型差異性(different-from-normal, DFN)相結(jié)合的識(shí)別模式[9-15]；③設(shè)計(jì)方案遵循骨架標(biāo)志+常見異常表達(dá)標(biāo)志原則，使用多標(biāo)志設(shè)門[9-15]；④為了保證靈敏度達(dá)到10-3～10-4, 樣本獲取至少活細(xì)胞20萬(wàn), 最好白細(xì)胞在50萬(wàn)～100萬(wàn)[9-15]，如果做白血病干細(xì)胞(leukemic stem cells, LSC)檢測(cè)，獲取活細(xì)胞400萬(wàn)～800萬(wàn)[16]；⑤外周血比骨髓白血病負(fù)荷低，建議首選骨髓[9-10, 17]。為了避免外周血稀釋，建議緊接形態(tài)的第一管做FCM[9-10]；⑥腦脊液MRD陽(yáng)性與不良預(yù)后有關(guān)，且FCM靈敏度高于細(xì)胞學(xué)，建議使用FCM法檢測(cè)腦脊液[1, 18]；⑦存在抗原漂移可能，不主張根據(jù)初治表型使用既定設(shè)門法[15, 19-20]；⑧近年來(lái)免疫治療等新技術(shù)的發(fā)展，在MRD檢測(cè)同時(shí)，對(duì)于難治復(fù)發(fā)病例通過(guò)免疫表型檢測(cè)，進(jìn)行靶向治療的靶點(diǎn)篩查；⑨隨著免疫治療后復(fù)發(fā)機(jī)制的研究，開始將腫瘤干細(xì)胞、免疫微環(huán)境、免疫檢查點(diǎn)與MRD一起進(jìn)行研究。即FCM檢測(cè)AML MRD，從單純實(shí)驗(yàn)室檢查逐步擴(kuò)展到治療方案選擇。在取得巨大進(jìn)展，F(xiàn)CM成為臨床上幾乎所有AML患者隨訪必做檢測(cè)項(xiàng)目同時(shí)，但是FCM檢查MRD也面臨一些問題。

1.1檢測(cè)方案 一般使用CD45及髓系原始標(biāo)志[CD34、CD117、HLA-DR和(或)CD33]作為骨架抗原，結(jié)合常見伴系標(biāo)志(如CD7、CD56、CD2、CD19、CD4等)、異常獲得標(biāo)志[CD96、CD366(Tim3)等]、過(guò)早獲得的成熟階段標(biāo)志(CD15、CD64、CD11b、CD11c、CD36、CD14等)、表達(dá)強(qiáng)度改變的髓系及早期標(biāo)志(CD13、CD33、CD371、CD38、CD123、CD200等)[9-17]。各種異常的發(fā)生率和識(shí)別難易度是方案設(shè)計(jì)的依據(jù)[13-17]。有兩種傾向，歐洲白血病網(wǎng)絡(luò)(European Leukemia Net, ELN)[10]等選擇固定的統(tǒng)一方案[3-4, 12-17]；另一種為相對(duì)個(gè)體化方法，即固定骨架和必做標(biāo)志，留出1～2個(gè)熒光通道，根據(jù)初治表型選做相應(yīng)的LAIP標(biāo)志[9]。

近年來(lái)AML LSC有進(jìn)入MRD檢測(cè)的趨勢(shì), 一般認(rèn)為免疫表型為CD34+/CD38-/CD45RA+/CD123+或者CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123+或者 CD45dimCD34+CD38-CD133+，其他標(biāo)志有CD371(CLL1)、Tim3、CD7、CD11b、CD22、CD56等[10, 14, 21-23]。CD33、CD44、CD47、CD123、CLL1、Tim3等標(biāo)志進(jìn)入靶向治療研究[21-22]。原發(fā)AML如果LSC比例高，提示預(yù)后不佳；不同AML的LSC異質(zhì)性強(qiáng), 且同一患者治療過(guò)程中可能會(huì)改變[21]。免疫表型和遺傳學(xué)有很強(qiáng)的相關(guān)性，成為個(gè)體化MRD檢測(cè)的基礎(chǔ)。見表1[12，24]。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AML MRD標(biāo)志與發(fā)生率

在所有血液腫瘤中，AML對(duì)于MRD檢測(cè)幾乎是難度最大，室間差異最大，甚至是室內(nèi)不同檢驗(yàn)醫(yī)師之間差異性最大的項(xiàng)目，原因在于：①AML本身的異質(zhì)性，包括多種亞型，亞型之間表型差異大，尤其是急性早幼粒細(xì)胞白血病和急性巨核細(xì)胞白血病，往往需要特殊的MRD方案；②同樣亞型的AML，也經(jīng)常存在異質(zhì)性克隆，尤其是急性粒單細(xì)胞白血病和急性單核細(xì)胞白血病；③隨著治療進(jìn)行，AML的抗原漂移發(fā)生率更高，而且缺乏規(guī)律性；④腫瘤之間表型異質(zhì)性大，每種異常的覆蓋率不高，造成很難用同一個(gè)方案高效檢測(cè)大多數(shù)患者M(jìn)RD，尤其是使用8色以下機(jī)型；⑤MRD是一個(gè)定期隨訪項(xiàng)目，國(guó)內(nèi)收費(fèi)限制一般做8色1～2管，8～16個(gè)標(biāo)志，其中骨架(設(shè)門)抗體占據(jù)3～8個(gè)，導(dǎo)致形成組合有限[3, 5, 9]；⑥初治往往在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院完成，可能檢測(cè)的LAIP和DFN標(biāo)志及組合有限，提供信息有限；⑦由于髓系標(biāo)志在大量成熟細(xì)胞中也表達(dá)，AML往往不能使用系別標(biāo)志設(shè)門，而CD34、CD117等早期標(biāo)志設(shè)門的覆蓋率不足90%，是AML漏診的原因之一，尤其是單核細(xì)胞和巨核細(xì)胞白血??；⑧骨髓中正常存在髓系原始細(xì)胞，而AML細(xì)胞很多時(shí)候與正常細(xì)胞表型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；⑨覆蓋率高的DFN，往往是正常表達(dá)標(biāo)志的熒光強(qiáng)度細(xì)微改變，以及標(biāo)志組合造成的改變，而感染、藥物、個(gè)體差異、抗體和組合的強(qiáng)度影響、標(biāo)本質(zhì)量、儀器穩(wěn)定性等原因都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，人工分析情況下，經(jīng)驗(yàn)性的依賴進(jìn)一步增加檢測(cè)精確度的變數(shù)。

1.2時(shí)間與閾值 多項(xiàng)研究表明，化療早期(16～18 d)、1和2次誘導(dǎo)治療后、鞏固治療后、移植前后(+28 d)，F(xiàn)CM檢測(cè)AML MRD對(duì)于選擇治療方法，判斷預(yù)后有很大意義[2-5，8，15]。造血干細(xì)胞移植后6個(gè)月內(nèi)MRD檢測(cè)以每月1次為宜，半年后至2年每3個(gè)月1次為宜，此外，移植后任何時(shí)間如果懷疑患者疾病進(jìn)展均可進(jìn)行MRD檢測(cè)[5]。關(guān)于陽(yáng)性結(jié)果的定義，雖然ELN等選擇0.1%作為閾值[4, 10, 16]，但是低于此閾值也有預(yù)后意義[2, 15, 17]。因此，F(xiàn)CM檢測(cè)AML MRD的靈敏度10-3～10-4甚至10-5，覆蓋率90%[5, 8, 10]。LSC初治時(shí)閾值0.004%～0.03%, 隨訪閾值10-6[14，16]。

影響檢測(cè)靈敏度和特異性的原因很多，對(duì)于不同的病例，采用統(tǒng)一閾值如0.1%并不恰當(dāng)。①個(gè)體差異，LAIP和DFN標(biāo)志多的患者，靈敏度可以達(dá)到10-4，甚至更高，而不表達(dá)早期標(biāo)志，尤其是與正常髓系細(xì)胞表型重疊性高的AML，靈敏度可能連10-2都很難達(dá)到；②標(biāo)本質(zhì)量，增生差或者嚴(yán)重稀釋的標(biāo)本，容易出現(xiàn)假陰性；③檢測(cè)者經(jīng)驗(yàn)和能力也是影響檢測(cè)結(jié)果的重要因素。因此，有些醫(yī)院采用的是看到即報(bào)的原則。在報(bào)告描述中，如果是MRD比例極低或者總體原始細(xì)胞比例極低，或者細(xì)胞數(shù)極少、成熟淋巴細(xì)胞比例極高提示標(biāo)本增生極差，或者粒細(xì)胞均為成熟階段缺乏有核紅細(xì)胞提示嚴(yán)重稀釋等，會(huì)在報(bào)告中予以注明，這些因素可能會(huì)造成假陽(yáng)性或者假陰性結(jié)果。

1.3方案合理性 AML中每種LAIP+DFN組合覆蓋率均不高，為了達(dá)到覆蓋率80%以上，經(jīng)常需要做多管或者差異化方案。目前關(guān)于方案設(shè)門的觀點(diǎn)：①盡量使用相對(duì)復(fù)雜的抗體組合去建立正常發(fā)育模式和抗原表達(dá)情況，DFN方案過(guò)于簡(jiǎn)單會(huì)使MRD與正常細(xì)胞重疊度高，導(dǎo)致假陰性；②盡量采用統(tǒng)一化方案，便于積累經(jīng)驗(yàn)，使用多維軟件回顧分析數(shù)據(jù)；③抗體克隆和熒光素會(huì)影響抗原表達(dá)強(qiáng)度，而伴系表達(dá)大多都是弱表達(dá)，盡量選擇可信克隆和較強(qiáng)熒光素；④抗原漂移問題在AML中位發(fā)生率61%(10%～91%)，且缺乏規(guī)律性[15, 19-20]。不能單純根據(jù)初治免疫表型使用預(yù)設(shè)方案檢測(cè)。

盡管如此，目前絕大多數(shù)醫(yī)院雖然在抗體種類和設(shè)計(jì)的選擇上相似度較高，但是組成方案差異很大。一些著名實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)方案供參考[2, 4, 9, 12-14]，見表2。

表2 幾種急性髓系白血病微小殘留病檢測(cè)方案

1.4現(xiàn)狀與挑戰(zhàn) MRD分析是對(duì)經(jīng)驗(yàn)性分析最大的挑戰(zhàn)，目前部分實(shí)驗(yàn)室還保留在使用CD45/側(cè)向散射光(side scatter，SSC)設(shè)門的原始階段；實(shí)驗(yàn)室會(huì)使用CD34/SSC設(shè)門，沒有使用CD117/SSC做內(nèi)對(duì)照，且只能報(bào)早期細(xì)胞比例，對(duì)沒有表達(dá)CD7、CD19、CD56的細(xì)胞不進(jìn)行判斷；國(guó)內(nèi)使用HLA-DR/CD45設(shè)門彌補(bǔ)CD34/SSC和CD117/SSC設(shè)門覆蓋率低(70%～90%)缺陷的單位尚不多；使用標(biāo)本內(nèi)對(duì)照，進(jìn)行細(xì)微DFN判斷的能力有待加強(qiáng)。

解決方法：①CD45/SSC, CD34/SSC、CD117/SSC、CD45/HLA-DR同步設(shè)門，防止漏掉不表達(dá)一個(gè)或者更多早期標(biāo)志的MRD(圖1)。如果是罕見的類型，如巨核白血病，需要使用CD42a/CD45、CD61/CD45設(shè)門；②幼稚細(xì)胞門內(nèi)尤其是CD117/SSC和(或)CD45/HLA-DR設(shè)門，可能同時(shí)存在正常和惡性髓系幼稚細(xì)胞，殘留正常幼稚細(xì)胞是很好的DFN內(nèi)對(duì)照，應(yīng)該精確設(shè)門區(qū)分正常與白血病細(xì)胞(圖1)；③有些白血病細(xì)胞與正常細(xì)胞相似度極高，DFN改變很微妙，此時(shí)兩種異常的組合會(huì)提高靈敏度，甚至使用軟件做多維圖(圖2雷達(dá)圖，圖3 tSNE)。相同panel分析的組合越多，維度越多，得到的信息越多；④熟悉正常骨髓表達(dá)情況，包括增生的骨髓、不同時(shí)間點(diǎn)、藥物與感染以及應(yīng)激狀態(tài)等因素影響等。

圖1 未表達(dá)CD34、CD117的AML MRD骨髓標(biāo)本 紅色細(xì)胞群為惡性髓系原始細(xì)胞，占有核細(xì)胞0.58%，未表達(dá)早期標(biāo)志CD34、CD117，表達(dá)HLA-DRbri、CD33bri、CD64、CD11bdim，未表達(dá)CD13、CD14。因?yàn)镃D45/HLA-DR P10設(shè)門包括增生的B祖細(xì)胞，使用CD45/SSC選擇SSC大的細(xì)胞P8設(shè)門，因此占有核細(xì)胞比例為P8×P10。P5(深藍(lán)色細(xì)胞群)和P7(深綠色細(xì)胞群)為正常增生的髓系原始細(xì)胞

圖2 骨髓標(biāo)本分析 a:正常髓系原始細(xì)胞(紅色為CD34陽(yáng)性早期髓系原始細(xì)胞，深藍(lán)色為CD117+CD34-晚期髓系原始細(xì)胞)。b:AML MRD(紅色為惡性髓系原始細(xì)胞，深藍(lán)色為正常髓系原始細(xì)胞)

圖3 正常與AML MRD骨髓標(biāo)本的組合tSNE 綠色細(xì)胞群為20個(gè)正常骨髓標(biāo)本組成的該方案正常對(duì)照?qǐng)D庫(kù)，a.紫色細(xì)胞群；b.紅色細(xì)胞群；c.粉紅色細(xì)胞群分別為3個(gè)AML患者M(jìn)RD細(xì)胞

2 技術(shù)進(jìn)步意義

2.1更多功能 質(zhì)譜流式[25]與全光譜流式[26]克服了傳統(tǒng)流式熒光通道相對(duì)較少、相似發(fā)射光譜的熒光素不能同時(shí)使用、熒光通道之間干擾大和補(bǔ)償較大等缺點(diǎn)，盡管目前存在一些問題(質(zhì)譜流式靈敏度低、樣本制備和采集速度低、價(jià)格高、復(fù)雜數(shù)據(jù)分析等，全光譜流式檢測(cè)方案設(shè)計(jì)復(fù)雜、單陽(yáng)管設(shè)置對(duì)解析影響大、繁復(fù)的數(shù)據(jù)分析等)，依舊成為行業(yè)內(nèi)期待的革命性機(jī)型，各自在MRD檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值及優(yōu)缺點(diǎn)見表3。隨著質(zhì)控問題的解決和軟件進(jìn)步，這些全新流式在臨床應(yīng)用會(huì)極大提高AML MRD檢測(cè)的靈敏度和特異性。

表3 傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)與新型流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)比較

2.2軟件進(jìn)步 Kaluza、Flowjo、Infinicyt、Cytobank等商業(yè)軟件的降維功能推動(dòng)了FCM MRD檢測(cè)。初步研究flowSOM檢測(cè)AML MRD, 與分子生物學(xué)一致率80.2%，靈敏度85%，特異性69%[27]；Infinicyt聚類算法檢測(cè)AML MRD靈敏度66.28%, 特異性99.9502%～99.9999%[28]。雖然靈敏度有待提高，但是看到了曙光。

2.3MRD新標(biāo)志 基因芯片技術(shù)的發(fā)展極大推動(dòng)了抗原標(biāo)志篩查，St. Jude一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)更多有望作為AML MRD檢測(cè)的標(biāo)志(表1)，結(jié)合降維軟件，有可能使一部分患者的檢測(cè)靈敏度提高到≤0.001%[24]。

2.4單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的結(jié)合 陳賽娟院士團(tuán)隊(duì)將免疫表型和RNA-測(cè)序(RNA-sequencing，RNA-seq)以及單細(xì)胞RNA測(cè)序(single-cell RNA-seq，scRNA-seq)整合分析, 發(fā)現(xiàn)同一患者標(biāo)本中，存在不同分化階段的AML腫瘤細(xì)胞群[29]，為將來(lái)MRD研究拓開新的思路。

3 前景展望

FCM檢測(cè)AML MRD，從十幾年前8色流式的推出，在3年前逐漸趨于完善[10]，同時(shí)也達(dá)到平臺(tái)期。超多色流式的推出以及高效智能軟件問世，有望從方案上解決抗體組合覆蓋率低的難題，且同步檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞、免疫細(xì)胞亞群、免疫檢查點(diǎn)、靶向治療靶點(diǎn)篩查，以及解決部分人員經(jīng)驗(yàn)的問題。但是盡管最理想的狀態(tài)下，技術(shù)進(jìn)步可能在未來(lái)3～5年將室間差異、人員經(jīng)驗(yàn)差異、儀器穩(wěn)定性、方案優(yōu)化和規(guī)范化等問題解決。鑒于AML的本質(zhì)，相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間里，找到高度特異性且高覆蓋率的AML MRD的一個(gè)標(biāo)志或者幾個(gè)標(biāo)志組合的可能性很小，即未來(lái)可能MRD依舊是能夠檢測(cè)到的MRD。

綜上所述，F(xiàn)CM檢測(cè)MRD具有很強(qiáng)的臨床指導(dǎo)意義，雖然目前尚在完善中，但是技術(shù)進(jìn)步帶來(lái)的推動(dòng)作用已經(jīng)顯現(xiàn)，將來(lái)可能會(huì)在提高靈敏度、特異性的同時(shí)，把腫瘤干細(xì)胞、免疫微環(huán)境、免疫檢查點(diǎn)研究相結(jié)合，為臨床提供更加全面的預(yù)后信息。