秦亞溱

(北京大學(xué)人民醫(yī)院，北京大學(xué)血液病研究所，國(guó)家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100044)

慢性髓性白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一種起源于多能造血干細(xì)胞的惡性腫瘤，染色體易位t(9;22)(q34;q11)形成的BCR-ABL融合基因是其特征性分子標(biāo)志[1-2]。本世紀(jì)以來(lái)，靶向BCR-ABL的伊馬替尼等酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)的應(yīng)用給CML治療帶來(lái)革命性變化，絕大部分患者的生存期已與常人相同，并可能實(shí)現(xiàn)功能性治愈[3-4]。BCR-ABL定量及突變檢測(cè)是CML患者診斷及長(zhǎng)期治療過(guò)程中療效監(jiān)測(cè)的基本手段，而檢測(cè)規(guī)范化是其發(fā)揮臨床指導(dǎo)作用的前提, 也是CML患者獲得最佳療效的保證。在此，將對(duì)CML患者BCR-ABL的規(guī)范化檢測(cè)及臨床應(yīng)用展開(kāi)探討。

1 CML患者BCR-ABL融合基因類(lèi)型

Ph染色體是人類(lèi)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)與特異惡性疾病----CML相關(guān)的染色體異常，隨后確認(rèn)是由染色體易位t(9;22)(q34;q11)所致[1]。在分子水平上，該異位導(dǎo)致22號(hào)染色體上的BCR與9號(hào)染色體上的ABL形成BCR-ABL融合基因[2]，從而使得ABL酪氨酸激酶處于持續(xù)活化狀態(tài)，這是CML發(fā)生的核心機(jī)制[5]。

在DNA水平上，BCR基因斷裂的區(qū)域主要分布于3處[6]：①內(nèi)含子1，又稱(chēng)為次要斷裂點(diǎn)簇集區(qū)(m-bcr)；②外顯子12～16，又稱(chēng)為主要斷裂點(diǎn)簇集區(qū)(M-bcr)；③內(nèi)含子19，又稱(chēng)為μ-bcr；ABL基因的斷裂區(qū)域跨越外顯子1b上游、外顯子1b和1a及外顯子1a下游。BCR-ABL融合基因轉(zhuǎn)錄翻譯后分別形成以下3種mRNA和蛋白：e1a2(P190)、e13a2/e14a2(均為P210)和e19a2(P230)；④還有少見(jiàn)的融合類(lèi)型，如e6a2、e13a3/e14a3等。為了保持讀碼框以正確翻譯ABL蛋白，BCR和ABL之間可能插入部分內(nèi)含子等序列或者BCR斷裂發(fā)生在外顯子上，如e8-int1b-a2等[7]。

90%～95%的CML患者初診時(shí)可檢測(cè)到Ph染色體。所有的CML患者均具有BCR-ABL融合基因，我們及國(guó)際報(bào)道均顯示約98% CML患者的BCR-ABL為P210型，其余2%為P230、P190或其它少見(jiàn)類(lèi)型[7]。

2 BCR-ABL檢測(cè)方法

由于P210型BCR-ABL在mRNA水平表現(xiàn)均一，因此可以將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后再通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增來(lái)確認(rèn)BCR-ABL融合基因的存在。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是在反應(yīng)體系中除了上下游引物之外加入了熒光探針或染料，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物的熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)真正準(zhǔn)確的定量起始模板。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)P210型BCR-ABLmRNA具有特異、敏感、快速以及準(zhǔn)確定量的特點(diǎn)，是當(dāng)前臨床常規(guī)的檢測(cè)方法[8-9]。進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR時(shí)，分別檢測(cè)BCR-ABL和內(nèi)參基因(如ABL)定量各自拷貝數(shù)，BCR-ABLmRNA水平表示公式如下。

(BCR-ABLcopies/ABL copies)×100%

對(duì)于P190和P230型BCR-ABL亦可分別采用各自特異的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法。對(duì)于各種少見(jiàn)BCR-ABL類(lèi)型，可通過(guò)多重定性或定量方法結(jié)合Sanger測(cè)序確定其存在以及融合類(lèi)型[7]。

目前ABL突變檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法是PCR結(jié)合Sanger測(cè)序法[8-9]，首先進(jìn)行巢式PCR，即先擴(kuò)增BCR-ABL，然后擴(kuò)增BCR-ABL上的ABL酪氨酸激酶區(qū)(包含第240～500個(gè)氨基酸)，再通過(guò)Sanger測(cè)序來(lái)明確BCR-ABL是否發(fā)生突變以及突變類(lèi)型。

3 CML患者BCR-ABL檢測(cè)的臨床應(yīng)用

BCR-ABL定量及突變檢測(cè)對(duì)于CML患者診斷及監(jiān)測(cè)具有重要意義。

3.1診斷 CML確診主要依據(jù)形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子學(xué)3個(gè)方面。對(duì)于絕大多數(shù)CML患者，Ph染色體及BCR-ABL融合基因這兩項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果一致。由于P210型BCR-ABL是CML患者的普遍類(lèi)型，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)到該mRNA并結(jié)合血液形態(tài)學(xué)表現(xiàn)即可快速確診。對(duì)于P210型BCR-ABL陽(yáng)性但Ph染色體未檢測(cè)到的情況，往往是由于異位隱匿或復(fù)雜異位掩蓋所致，仍可以診斷為CML。當(dāng)檢測(cè)到Ph染色體而P210型BCR-ABL未檢測(cè)到時(shí)，提示存在其他的BCR-ABL類(lèi)型，需通過(guò)多重PCR方法進(jìn)行全面的BCR-ABL類(lèi)型篩查，并通過(guò)熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization, FISH)技術(shù)確認(rèn)BCR-ABL融合基因的存在。2020年歐洲白血病網(wǎng)(ELN)關(guān)于CML治療的推薦提出，CML患者初診時(shí)需確定BCR-ABL融合基因類(lèi)型，以便后續(xù)監(jiān)測(cè)分子學(xué)反應(yīng)采用合適的檢測(cè)體系[10]。

3.2指導(dǎo)治療 TKI是當(dāng)前CML治療的一線藥物。由于大部分CML患者可以通過(guò)TKI治療很快獲得完全細(xì)胞遺傳學(xué)緩解(CCyR)，更低水平的腫瘤負(fù)荷需要采用更加敏感的分子學(xué)檢測(cè)技術(shù)。采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)BCR-ABLmRNA水平可以準(zhǔn)確反映白血病負(fù)荷，可用于CML患者分子學(xué)反應(yīng)評(píng)估。ELN推薦、美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南及中國(guó)CML指南中對(duì)CML患者TKI療效評(píng)估，均采用里程碑的方式[10-12]，即依據(jù)治療后特定的時(shí)間點(diǎn)是否獲得特定的細(xì)胞遺傳學(xué)(Ph染色體陽(yáng)性率)及分子學(xué)反應(yīng)(BCR-ABLmRNA水平)，評(píng)估患者是否獲得最佳療效，并提示是否需要換用二代或三代TKI。2020年版ELN推薦進(jìn)一步簡(jiǎn)化為僅根據(jù)特定時(shí)間點(diǎn)的BCR-ABLmRNA水平評(píng)估TKI療效，見(jiàn)表1[10]。

表1 歐洲白血病網(wǎng)(ELN)推薦：慢性髓性白血病治療(2020年版)[10]

研究顯示，CML患者獲得深層次的分子學(xué)反應(yīng)(一般認(rèn)為≥MR4.5，即BCR-ABLmRNA水平較初診下降≥4.5 logs)之后有可能停用TKI并保持主要分子學(xué)反應(yīng)(major molecular response, MMR)，指BCR-ABLmRNA水平較初診下降3 logs即實(shí)現(xiàn)功能性治愈[13]。停藥既能提高患者生存質(zhì)量又可以降低國(guó)家醫(yī)療保險(xiǎn)負(fù)擔(dān)，因而是當(dāng)前CML治療追求的目標(biāo)。BCR-ABLmRNA水平既是停藥也是停藥后重新服藥的基本指征，在停藥前后均需要定期密切監(jiān)測(cè)。

TKI治療過(guò)程中可能發(fā)生耐藥，ABL酪氨酸激酶區(qū)發(fā)生突變是耐藥的重要原因[14]。依據(jù)指南評(píng)估，當(dāng)正確服藥的CML患者未獲得最佳療效時(shí)需要進(jìn)行ABL激酶區(qū)突變檢測(cè)[10-12]。由于二代TKIs和三代TKIs對(duì)不同的突變類(lèi)型敏感性不同，因此突變表現(xiàn)可指導(dǎo)后續(xù)TKIs的選擇[10-12]。

4 CML患者BCR-ABL定量檢測(cè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化

與其他的血液學(xué)診斷技術(shù)相比，PCR具有實(shí)驗(yàn)步驟和影響因素較多的特點(diǎn)。檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定是BCR-ABL監(jiān)測(cè)真正發(fā)揮臨床指導(dǎo)作用的前提。為做到這一點(diǎn)，必須采用標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)方案，執(zhí)行嚴(yán)格的室內(nèi)質(zhì)量控制措施，這樣才能讓患者在同一家實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的結(jié)果具有可比性，正確評(píng)估分子學(xué)反應(yīng)，指導(dǎo)臨床治療。

由于試劑、儀器以及內(nèi)參基因的不同等影響，既使檢測(cè)準(zhǔn)確、穩(wěn)定，不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)同一份樣本得出的BCR-ABLmRNA水平很可能不同，因此不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果不具有可比性。為解決這個(gè)問(wèn)題，國(guó)際CML專(zhuān)家于2005年共同提出BCR-ABL定量檢測(cè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)(international scale, IS)的概念[15]，即通過(guò)轉(zhuǎn)換系數(shù)(conversion factor, CF)，將各實(shí)驗(yàn)室BCR-ABL檢測(cè)值均轉(zhuǎn)換為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)值(BCR-ABLIS)，根據(jù)BCR-ABLIS可直接判斷CML患者分子學(xué)反應(yīng)，常用的分子學(xué)反應(yīng)指標(biāo)及定義。見(jiàn)表2。

表2 慢性髓性白血病常用分子學(xué)反應(yīng)指標(biāo)及定義

因此，通過(guò)采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的BCR-ABL可以正確評(píng)估CML患者分子學(xué)反應(yīng)，從而有效發(fā)揮臨床治療指導(dǎo)作用。目前BCR-ABLIS僅適用于具有P210型BCR-ABL的CML患者，其他類(lèi)型的BCR-ABL尚未引入國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的概念，分子學(xué)反應(yīng)可采用與初診相比BCR-ABL下降log的評(píng)估方式。

5 用于轉(zhuǎn)換BCR-ABLIS的CF獲得

執(zhí)行BCR-ABL國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的核心是CF，有效CF的獲得可通過(guò)與參比實(shí)驗(yàn)室交換樣品或與商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)物比對(duì)來(lái)實(shí)現(xiàn)。其中前者應(yīng)用更為廣泛。與參比實(shí)驗(yàn)室比較過(guò)程，通常包括兩批派發(fā)樣本檢測(cè)比對(duì)[16-17]，第一批比對(duì)是為了計(jì)算CF，第二批為了驗(yàn)證CF，即評(píng)估計(jì)算出的CF是否可以準(zhǔn)確轉(zhuǎn)換第二批樣本BCR-ABL。只有驗(yàn)證結(jié)果合格，才能說(shuō)明BCR-ABL檢測(cè)準(zhǔn)確并穩(wěn)定，該CF可用于CML患者轉(zhuǎn)換BCR-ABL。澳大利亞醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)科學(xué)研究所(IMVS)國(guó)際參比實(shí)驗(yàn)室報(bào)道[16]，與IMVS進(jìn)行樣本交換38家實(shí)驗(yàn)室中有19家進(jìn)行了驗(yàn)證，其中11家合格獲得有效的CF，利用有效CF轉(zhuǎn)換BCR-ABLIS之后使得實(shí)驗(yàn)室間MMR一致率明顯提高。歐洲亦開(kāi)展了基于樣本比對(duì)的CF獲得的工作[17]，他們形成多級(jí)網(wǎng)絡(luò)，即首先由位于德國(guó)曼海姆的國(guó)際參比實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證26個(gè)國(guó)家級(jí)參比實(shí)驗(yàn)室獲得有效CF，再由這些實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證本國(guó)的其他實(shí)驗(yàn)室。

6 國(guó)內(nèi)BCR-ABL定量檢測(cè)規(guī)范化進(jìn)展

為了實(shí)現(xiàn)BCR-ABL規(guī)范化檢測(cè)并緊跟國(guó)際進(jìn)展，北京大學(xué)人民醫(yī)院北京大學(xué)血液病研究所于2010年?duì)款^啟動(dòng)了國(guó)內(nèi)白血病分子檢測(cè)領(lǐng)域首個(gè)多中心規(guī)范化項(xiàng)目—“中國(guó)CML患者定量PCR檢測(cè)合作項(xiàng)目”。 2012年，北京大學(xué)血液病研究所通過(guò)與澳大利亞IMVS國(guó)際參比實(shí)驗(yàn)室比對(duì)獲得有效CF。隨后，北京大學(xué)血液病研究所做為國(guó)內(nèi)唯一的參比實(shí)驗(yàn)室，每年通過(guò)兩批樣本派發(fā)比對(duì)幫助其他實(shí)驗(yàn)室獲得有效CF[18]。到目前為止，全國(guó)實(shí)驗(yàn)室參與本項(xiàng)目80余家，其中73家已獲得CF實(shí)現(xiàn)臨床報(bào)告BCR-ABLIS。此外，CF獲得后并非一勞永逸，只有在檢測(cè)穩(wěn)定的前提下才一直可用。就此，北京大學(xué)血液病研究所每年還通過(guò)派發(fā)一批次比對(duì)樣本來(lái)進(jìn)行已獲得CF實(shí)驗(yàn)室的再驗(yàn)證[19]，如果合格說(shuō)明檢測(cè)穩(wěn)定CF繼續(xù)使用，如果不合格則提示檢測(cè)過(guò)程出現(xiàn)問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)室需要檢查操作規(guī)程，針對(duì)新的檢測(cè)狀態(tài)需要重新計(jì)算CF。因此，“中國(guó)CML患者定量PCR檢測(cè)合作項(xiàng)目”促進(jìn)了國(guó)內(nèi)CML分子學(xué)反應(yīng)評(píng)估與國(guó)際接軌，并發(fā)揮了BCR-ABL檢測(cè)規(guī)范化的外部質(zhì)控的作用。

7 ABL突變的規(guī)范化檢測(cè)

ABL突變的檢測(cè)同樣需要規(guī)范化，具體內(nèi)容可參見(jiàn)已發(fā)表的實(shí)驗(yàn)室規(guī)范中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)[20]。在此特別強(qiáng)調(diào)的是，為保證結(jié)果真實(shí)可靠，測(cè)序圖譜的判讀一定認(rèn)真謹(jǐn)慎；只有背景干凈的測(cè)序圖譜才能用于判斷ABL突變；對(duì)于小突變峰如果不好判斷需重新擴(kuò)增測(cè)序。

新一代測(cè)序(next generation sequencing, NGS)技術(shù)正逐步進(jìn)入惡性血液病臨床應(yīng)用，由于其高敏感性及可定量的優(yōu)點(diǎn)，2020年ELN推薦指出可采用NGS檢測(cè)ABL突變[10]。不過(guò)目前在國(guó)內(nèi)，尚待數(shù)據(jù)支持和專(zhuān)門(mén)的規(guī)范檢測(cè)指南的出現(xiàn)。

8 采用外周血標(biāo)本規(guī)范監(jiān)測(cè)CML患者BCR-ABL

規(guī)范化的BCR-ABL檢測(cè)還體現(xiàn)在樣本類(lèi)型上。盡管骨髓是白血病患者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的基本樣本類(lèi)型，但是外周血與骨髓相比具有患者痛苦小、取材方便等優(yōu)點(diǎn)。CML患者初診時(shí)，外周血往往具有與骨髓相似的髓系各階段細(xì)胞組成，提示CML患者有可能采用外周血檢測(cè)。Brandford等[21]報(bào)道，外周血定量檢測(cè)BCR-ABL能夠可靠反映CML療效。隨后的有關(guān)TKIs治療CML的各個(gè)國(guó)際臨床實(shí)驗(yàn)均是采用外周血檢測(cè)BCR-ABL。江倩等[22]采用國(guó)際上最大宗的樣本量，通過(guò)外周血與骨髓的配對(duì)研究顯示，CML患者接受伊馬替尼治療后外周血與骨髓的BCR-ABLmRNA水平總體上具有很高的一致性，并且外周血比骨髓的敏感性更高。由于基于臨床實(shí)驗(yàn)制定的CML治療指南及推薦中療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)均是基于外周血的數(shù)據(jù)[10-12]，而有些患者外周血和骨髓結(jié)果之間存在一定差異。因此，在執(zhí)行指南評(píng)估CML患者TKIs療效時(shí)應(yīng)該持續(xù)采用規(guī)范化的樣本----外周血檢測(cè)BCR-ABL。

9 結(jié)語(yǔ)及展望

基于TKIs的成功研制及廣泛應(yīng)用，當(dāng)前CML的診斷、治療及監(jiān)測(cè)已建成完整而清晰的規(guī)范化體系，因此目前存在的主要問(wèn)題在于執(zhí)行。一方面是臨床層面，除了規(guī)范服藥外還需規(guī)范監(jiān)測(cè)，CML患者應(yīng)堅(jiān)持每3個(gè)月做1次外周血BCR-ABL定量檢測(cè)，在BCR-ABL提示升高時(shí)以及停藥后等特殊階段還需要增加檢測(cè)次數(shù)，當(dāng)未達(dá)最佳療效時(shí)需檢測(cè)ABL突變，以便指導(dǎo)臨床治療。另一方面是實(shí)驗(yàn)室層面，需嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程以保證BCR-ABL定量和突變檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確而穩(wěn)定，并通過(guò)參加樣本比對(duì)或與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)的方式獲得CF，以報(bào)告BCR-ABLIS，發(fā)揮正確的指導(dǎo)臨床治療作用。

分子學(xué)檢測(cè)在惡性血液病診斷監(jiān)測(cè)中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，規(guī)范化檢測(cè)是發(fā)揮臨床指導(dǎo)作用的基石。CML患者BCR-ABL的規(guī)范化檢測(cè)為其它分子學(xué)指標(biāo)提供了很好的范例。