秦亞溱

(北京大學人民醫(yī)院，北京大學血液病研究所，國家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心，北京 100044)

慢性髓性白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一種起源于多能造血干細胞的惡性腫瘤，染色體易位t(9;22)(q34;q11)形成的BCR-ABL融合基因是其特征性分子標志[1-2]。本世紀以來，靶向BCR-ABL的伊馬替尼等酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)的應(yīng)用給CML治療帶來革命性變化，絕大部分患者的生存期已與常人相同，并可能實現(xiàn)功能性治愈[3-4]。BCR-ABL定量及突變檢測是CML患者診斷及長期治療過程中療效監(jiān)測的基本手段，而檢測規(guī)范化是其發(fā)揮臨床指導作用的前提, 也是CML患者獲得最佳療效的保證。在此，將對CML患者BCR-ABL的規(guī)范化檢測及臨床應(yīng)用展開探討。

1 CML患者BCR-ABL融合基因類型

Ph染色體是人類發(fā)現(xiàn)的第一個與特異惡性疾病----CML相關(guān)的染色體異常，隨后確認是由染色體易位t(9;22)(q34;q11)所致[1]。在分子水平上，該異位導致22號染色體上的BCR與9號染色體上的ABL形成BCR-ABL融合基因[2]，從而使得ABL酪氨酸激酶處于持續(xù)活化狀態(tài)，這是CML發(fā)生的核心機制[5]。

在DNA水平上，BCR基因斷裂的區(qū)域主要分布于3處[6]：①內(nèi)含子1，又稱為次要斷裂點簇集區(qū)(m-bcr)；②外顯子12～16，又稱為主要斷裂點簇集區(qū)(M-bcr)；③內(nèi)含子19，又稱為μ-bcr；ABL基因的斷裂區(qū)域跨越外顯子1b上游、外顯子1b和1a及外顯子1a下游。BCR-ABL融合基因轉(zhuǎn)錄翻譯后分別形成以下3種mRNA和蛋白：e1a2(P190)、e13a2/e14a2(均為P210)和e19a2(P230)；④還有少見的融合類型，如e6a2、e13a3/e14a3等。為了保持讀碼框以正確翻譯ABL蛋白，BCR和ABL之間可能插入部分內(nèi)含子等序列或者BCR斷裂發(fā)生在外顯子上，如e8-int1b-a2等[7]。

90%～95%的CML患者初診時可檢測到Ph染色體。所有的CML患者均具有BCR-ABL融合基因，我們及國際報道均顯示約98% CML患者的BCR-ABL為P210型，其余2%為P230、P190或其它少見類型[7]。

2 BCR-ABL檢測方法

由于P210型BCR-ABL在mRNA水平表現(xiàn)均一，因此可以將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后再通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增來確認BCR-ABL融合基因的存在。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，實時定量PCR技術(shù)是在反應(yīng)體系中除了上下游引物之外加入了熒光探針或染料，通過實時檢測擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)的產(chǎn)物的熒光信號，實現(xiàn)真正準確的定量起始模板。實時定量PCR檢測P210型BCR-ABLmRNA具有特異、敏感、快速以及準確定量的特點，是當前臨床常規(guī)的檢測方法[8-9]。進行實時定量PCR時，分別檢測BCR-ABL和內(nèi)參基因(如ABL)定量各自拷貝數(shù)，BCR-ABLmRNA水平表示公式如下。

(BCR-ABLcopies/ABL copies)×100%

對于P190和P230型BCR-ABL亦可分別采用各自特異的實時定量PCR檢測方法。對于各種少見BCR-ABL類型，可通過多重定性或定量方法結(jié)合Sanger測序確定其存在以及融合類型[7]。

目前ABL突變檢測的標準方法是PCR結(jié)合Sanger測序法[8-9]，首先進行巢式PCR，即先擴增BCR-ABL，然后擴增BCR-ABL上的ABL酪氨酸激酶區(qū)(包含第240～500個氨基酸)，再通過Sanger測序來明確BCR-ABL是否發(fā)生突變以及突變類型。

3 CML患者BCR-ABL檢測的臨床應(yīng)用

BCR-ABL定量及突變檢測對于CML患者診斷及監(jiān)測具有重要意義。

3.1診斷 CML確診主要依據(jù)形態(tài)學、細胞遺傳學和分子學3個方面。對于絕大多數(shù)CML患者，Ph染色體及BCR-ABL融合基因這兩項檢測結(jié)果一致。由于P210型BCR-ABL是CML患者的普遍類型，通過實時定量PCR檢測到該mRNA并結(jié)合血液形態(tài)學表現(xiàn)即可快速確診。對于P210型BCR-ABL陽性但Ph染色體未檢測到的情況，往往是由于異位隱匿或復雜異位掩蓋所致，仍可以診斷為CML。當檢測到Ph染色體而P210型BCR-ABL未檢測到時，提示存在其他的BCR-ABL類型，需通過多重PCR方法進行全面的BCR-ABL類型篩查，并通過熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization, FISH)技術(shù)確認BCR-ABL融合基因的存在。2020年歐洲白血病網(wǎng)(ELN)關(guān)于CML治療的推薦提出，CML患者初診時需確定BCR-ABL融合基因類型，以便后續(xù)監(jiān)測分子學反應(yīng)采用合適的檢測體系[10]。

3.2指導治療 TKI是當前CML治療的一線藥物。由于大部分CML患者可以通過TKI治療很快獲得完全細胞遺傳學緩解(CCyR)，更低水平的腫瘤負荷需要采用更加敏感的分子學檢測技術(shù)。采用實時定量PCR技術(shù)檢測BCR-ABLmRNA水平可以準確反映白血病負荷，可用于CML患者分子學反應(yīng)評估。ELN推薦、美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南及中國CML指南中對CML患者TKI療效評估，均采用里程碑的方式[10-12]，即依據(jù)治療后特定的時間點是否獲得特定的細胞遺傳學(Ph染色體陽性率)及分子學反應(yīng)(BCR-ABLmRNA水平)，評估患者是否獲得最佳療效，并提示是否需要換用二代或三代TKI。2020年版ELN推薦進一步簡化為僅根據(jù)特定時間點的BCR-ABLmRNA水平評估TKI療效，見表1[10]。

表1 歐洲白血病網(wǎng)(ELN)推薦：慢性髓性白血病治療(2020年版)[10]

研究顯示，CML患者獲得深層次的分子學反應(yīng)(一般認為≥MR4.5，即BCR-ABLmRNA水平較初診下降≥4.5 logs)之后有可能停用TKI并保持主要分子學反應(yīng)(major molecular response, MMR)，指BCR-ABLmRNA水平較初診下降3 logs即實現(xiàn)功能性治愈[13]。停藥既能提高患者生存質(zhì)量又可以降低國家醫(yī)療保險負擔，因而是當前CML治療追求的目標。BCR-ABLmRNA水平既是停藥也是停藥后重新服藥的基本指征，在停藥前后均需要定期密切監(jiān)測。

TKI治療過程中可能發(fā)生耐藥，ABL酪氨酸激酶區(qū)發(fā)生突變是耐藥的重要原因[14]。依據(jù)指南評估，當正確服藥的CML患者未獲得最佳療效時需要進行ABL激酶區(qū)突變檢測[10-12]。由于二代TKIs和三代TKIs對不同的突變類型敏感性不同，因此突變表現(xiàn)可指導后續(xù)TKIs的選擇[10-12]。

4 CML患者BCR-ABL定量檢測國際標準化

與其他的血液學診斷技術(shù)相比，PCR具有實驗步驟和影響因素較多的特點。檢測結(jié)果準確、穩(wěn)定是BCR-ABL監(jiān)測真正發(fā)揮臨床指導作用的前提。為做到這一點，必須采用標準化的實驗方案，執(zhí)行嚴格的室內(nèi)質(zhì)量控制措施，這樣才能讓患者在同一家實驗室檢測的結(jié)果具有可比性，正確評估分子學反應(yīng)，指導臨床治療。

由于試劑、儀器以及內(nèi)參基因的不同等影響，既使檢測準確、穩(wěn)定，不同實驗室檢測同一份樣本得出的BCR-ABLmRNA水平很可能不同，因此不同實驗室的結(jié)果不具有可比性。為解決這個問題，國際CML專家于2005年共同提出BCR-ABL定量檢測國際標準(international scale, IS)的概念[15]，即通過轉(zhuǎn)換系數(shù)(conversion factor, CF)，將各實驗室BCR-ABL檢測值均轉(zhuǎn)換為國際標準值(BCR-ABLIS)，根據(jù)BCR-ABLIS可直接判斷CML患者分子學反應(yīng)，常用的分子學反應(yīng)指標及定義。見表2。

表2 慢性髓性白血病常用分子學反應(yīng)指標及定義

因此，通過采用國際標準化的BCR-ABL可以正確評估CML患者分子學反應(yīng)，從而有效發(fā)揮臨床治療指導作用。目前BCR-ABLIS僅適用于具有P210型BCR-ABL的CML患者，其他類型的BCR-ABL尚未引入國際標準化的概念，分子學反應(yīng)可采用與初診相比BCR-ABL下降log的評估方式。

5 用于轉(zhuǎn)換BCR-ABLIS的CF獲得

執(zhí)行BCR-ABL國際標準化的核心是CF，有效CF的獲得可通過與參比實驗室交換樣品或與商業(yè)化標準物比對來實現(xiàn)。其中前者應(yīng)用更為廣泛。與參比實驗室比較過程，通常包括兩批派發(fā)樣本檢測比對[16-17]，第一批比對是為了計算CF，第二批為了驗證CF，即評估計算出的CF是否可以準確轉(zhuǎn)換第二批樣本BCR-ABL。只有驗證結(jié)果合格，才能說明BCR-ABL檢測準確并穩(wěn)定，該CF可用于CML患者轉(zhuǎn)換BCR-ABL。澳大利亞醫(yī)學和獸醫(yī)科學研究所(IMVS)國際參比實驗室報道[16]，與IMVS進行樣本交換38家實驗室中有19家進行了驗證，其中11家合格獲得有效的CF，利用有效CF轉(zhuǎn)換BCR-ABLIS之后使得實驗室間MMR一致率明顯提高。歐洲亦開展了基于樣本比對的CF獲得的工作[17]，他們形成多級網(wǎng)絡(luò)，即首先由位于德國曼海姆的國際參比實驗室驗證26個國家級參比實驗室獲得有效CF，再由這些實驗室驗證本國的其他實驗室。

6 國內(nèi)BCR-ABL定量檢測規(guī)范化進展

為了實現(xiàn)BCR-ABL規(guī)范化檢測并緊跟國際進展，北京大學人民醫(yī)院北京大學血液病研究所于2010年牽頭啟動了國內(nèi)白血病分子檢測領(lǐng)域首個多中心規(guī)范化項目—“中國CML患者定量PCR檢測合作項目”。 2012年，北京大學血液病研究所通過與澳大利亞IMVS國際參比實驗室比對獲得有效CF。隨后，北京大學血液病研究所做為國內(nèi)唯一的參比實驗室，每年通過兩批樣本派發(fā)比對幫助其他實驗室獲得有效CF[18]。到目前為止，全國實驗室參與本項目80余家，其中73家已獲得CF實現(xiàn)臨床報告BCR-ABLIS。此外，CF獲得后并非一勞永逸，只有在檢測穩(wěn)定的前提下才一直可用。就此，北京大學血液病研究所每年還通過派發(fā)一批次比對樣本來進行已獲得CF實驗室的再驗證[19]，如果合格說明檢測穩(wěn)定CF繼續(xù)使用，如果不合格則提示檢測過程出現(xiàn)問題，實驗室需要檢查操作規(guī)程，針對新的檢測狀態(tài)需要重新計算CF。因此，“中國CML患者定量PCR檢測合作項目”促進了國內(nèi)CML分子學反應(yīng)評估與國際接軌，并發(fā)揮了BCR-ABL檢測規(guī)范化的外部質(zhì)控的作用。

7 ABL突變的規(guī)范化檢測

ABL突變的檢測同樣需要規(guī)范化，具體內(nèi)容可參見已發(fā)表的實驗室規(guī)范中國專家共識[20]。在此特別強調(diào)的是，為保證結(jié)果真實可靠，測序圖譜的判讀一定認真謹慎；只有背景干凈的測序圖譜才能用于判斷ABL突變；對于小突變峰如果不好判斷需重新擴增測序。

新一代測序(next generation sequencing, NGS)技術(shù)正逐步進入惡性血液病臨床應(yīng)用，由于其高敏感性及可定量的優(yōu)點，2020年ELN推薦指出可采用NGS檢測ABL突變[10]。不過目前在國內(nèi)，尚待數(shù)據(jù)支持和專門的規(guī)范檢測指南的出現(xiàn)。

8 采用外周血標本規(guī)范監(jiān)測CML患者BCR-ABL

規(guī)范化的BCR-ABL檢測還體現(xiàn)在樣本類型上。盡管骨髓是白血病患者實驗室檢測的基本樣本類型，但是外周血與骨髓相比具有患者痛苦小、取材方便等優(yōu)點。CML患者初診時，外周血往往具有與骨髓相似的髓系各階段細胞組成，提示CML患者有可能采用外周血檢測。Brandford等[21]報道，外周血定量檢測BCR-ABL能夠可靠反映CML療效。隨后的有關(guān)TKIs治療CML的各個國際臨床實驗均是采用外周血檢測BCR-ABL。江倩等[22]采用國際上最大宗的樣本量，通過外周血與骨髓的配對研究顯示，CML患者接受伊馬替尼治療后外周血與骨髓的BCR-ABLmRNA水平總體上具有很高的一致性，并且外周血比骨髓的敏感性更高。由于基于臨床實驗制定的CML治療指南及推薦中療效評估標準均是基于外周血的數(shù)據(jù)[10-12]，而有些患者外周血和骨髓結(jié)果之間存在一定差異。因此，在執(zhí)行指南評估CML患者TKIs療效時應(yīng)該持續(xù)采用規(guī)范化的樣本----外周血檢測BCR-ABL。

9 結(jié)語及展望

基于TKIs的成功研制及廣泛應(yīng)用，當前CML的診斷、治療及監(jiān)測已建成完整而清晰的規(guī)范化體系，因此目前存在的主要問題在于執(zhí)行。一方面是臨床層面，除了規(guī)范服藥外還需規(guī)范監(jiān)測，CML患者應(yīng)堅持每3個月做1次外周血BCR-ABL定量檢測，在BCR-ABL提示升高時以及停藥后等特殊階段還需要增加檢測次數(shù)，當未達最佳療效時需檢測ABL突變，以便指導臨床治療。另一方面是實驗室層面，需嚴格執(zhí)行標準操作規(guī)程以保證BCR-ABL定量和突變檢測結(jié)果準確而穩(wěn)定，并通過參加樣本比對或與標準品比對的方式獲得CF，以報告BCR-ABLIS，發(fā)揮正確的指導臨床治療作用。

分子學檢測在惡性血液病診斷監(jiān)測中發(fā)揮著越來越重要的作用，規(guī)范化檢測是發(fā)揮臨床指導作用的基石。CML患者BCR-ABL的規(guī)范化檢測為其它分子學指標提供了很好的范例。