張桂寧，方弟安

(1.中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心,農業(yè)農村部長江下游漁業(yè)資源環(huán)境科學觀測實驗站,江蘇無錫 214081；2.上海海洋大學 水產科學國家級實驗教學示范中心,上海 201306)

翹嘴鲌(CulteralburnusBasilewsky)隸屬鯉科(Cyprinidae)鲌亞科(Cultrinae)鲌屬(Culter)，分布廣泛，具有較高的經濟價值和生態(tài)價值[1]。近年來針對翹嘴鲌的研究較多集中在形態(tài)特征[2]、營養(yǎng)成分[3]、年齡結構和生長特性[4]、人工養(yǎng)殖[5]、育種[6]和遺傳多樣性[7]等方面，但基于COI基因對翹嘴鲌自然種群間遺傳多樣性和遺傳結構方面的研究較少[8]。魚類遺傳多樣性研究有利于了解現有物種的種質資源現狀，為資源的合理利用和保護提供正確的理論指導和科學依據[9]。遺傳多樣性的研究方法有形態(tài)學標記、細胞學標記、生化標記和分子標記等，基于分子水平的研究方法中，利用線粒體DNA作為遺傳標記進行群體遺傳多樣性的研究較多[10]。魚類線粒體DNA(mtDNA)分子小且有長度多態(tài)性、母系遺傳和進化速度快等特點，是群體遺傳學中常用的遺傳標記[11]。細胞色素c氧化酶亞基I(COI)基因是線粒體DNA上的一段蛋白質編碼基因，具有引物通用性高、長度適宜和進化速率適中等特點，已廣泛應用于群體遺傳學研究[12]。

長江是我國淡水魚類的種質資源庫和基因庫[13]，20世紀80年代以來，長江魚類資源出現衰退現象。實施長江春季禁漁后，經濟魚種所占比例明顯增多，較大規(guī)格經濟魚類比例增加[14]。太湖是中國五大淡水湖之一，翹嘴鲌是著名的“太湖三白”之一。淀山湖和長漾湖均是長江下游的典型湖泊，是翹嘴鲌的適宜生存水域，生態(tài)地位突出，翹嘴鲌是上述湖區(qū)主要的經濟物種，近幾年翹嘴鲌群體資源呈現衰退嚴重，種群低齡化和小型化趨勢[15]。因此，本研究擬利用COI基因序列分析長江水域江蘇段和長江下游3個典型湖泊(淀山湖、太湖和長漾湖)的翹嘴鲌群體的遺傳多樣性和遺傳變異，以期為翹嘴鲌群體進行針對性保護和可持續(xù)利用提供科學支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

利用常規(guī)漁業(yè)資源調查的方法，使用定制絲網，分別于淀山湖(DSH)、太湖(TH)、長漾湖(CYH)和長江江蘇段(CJ)隨機捕獲翹嘴鲌，剪取尾鰭浸泡于95%的無水乙醇中保存，其中長江江蘇段翹嘴鲌91尾，淀山湖66尾，太湖69尾，長漾湖67尾，共計293尾，采樣水域如圖1所示。

圖1 翹嘴鲌采樣水域Fig.1 Sampling waters for C.alburnus

1.2 DNA提取

將備用的鰭條樣品剪取約30 mg的組織樣品于離心管中，使用試劑盒法提取DNA(海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒DP324，北京天根生化有限公司)，并用濃度1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA質量，合格的DNA樣品置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR和DNA測序

依據翹嘴鲌線粒體基因序列(GenBank登錄號：KX244762.1)，利用Primer Premier軟件設計COI基因的引物,由亦欣生物科技(上海)有限公司合成。引物序列為COI-F:5′-CCGAACTTAGCCAACCCG-3′COI-R:5′-GACGGCGGTAATAAGGAC-3′。

PCR反應體系:總體積25 μL,包括 dNTP Mixture 12 μL，上、下游引物各0.5 μL(50 μmol/L)，DNA 2 μL，ddH2O 10 μL。

PCR擴增程序:94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃結束。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物后，將條帶清晰、擴增有效的PCR產物送亦欣生物科技(上海)有限公司進行雙向測序，測序引物與擴增引物一致。

1.4 數據分析

采用MEGA7.0.26軟件中的Align by clustal W軟件進行COI基因原始序列的比對、剪切。用DNASPv5[16]軟件計算群體單倍型，DNASPv5軟件進行Tajima′sD和FuLiF的中性檢驗，以衡量群體是否發(fā)生了擴張。采用Arlequin3.5軟件[17]進行遺傳多樣性、群體的分子方差分析(Analysis of molecular variance,AMOVA)、遺傳距離和基因流(Nm)值的計算。在MEGA7.0.26軟件中以Kimura雙參數法(Kimura-2-parameter)為替代模型，采用Neighbour-joining(NJ)法構建翹嘴鲌不同種群單倍型的分子聚類樹，從分支關系分析各群體之間的親緣遠近關系。

2 結果

2.1 線粒體COI堿基組成與序列變異分析

利用Clustal X軟件對測序所獲的目的片段進行校對剪切，獲得長度為816 bp的同源序列。4個群體共777個位點，共檢測到302個多態(tài)性位點，占總位點數的38.87%，定義了43個單倍型。COI序列中堿基A、T、C和G的平均含量分別為 26.3%、28.7%、26.8%和18.2%，其中T堿基含量最高，G堿基含量最低，且A+T的平均含量(55%)高于C+G的平均含量(45%)，表現出明顯的AT偏倚性。

2.2 遺傳多樣性和遺傳結構分析

293尾翹嘴鲌的單倍型多樣性是0.639～0.912，核苷酸多樣性是0.005 2～0.087 4(表1)。CJ群體總共91尾，34個單倍型，300個多態(tài)性位點，單倍型多樣性是0.912±0.000 32，核苷酸多樣性0.087 4。所有湖泊的翹嘴鲌樣本共有293尾，單倍型多樣性是0.851±0.001 9，核苷酸多樣性是0.008 54；CYH群體共67尾，12個單倍型，172個多態(tài)性位點，單倍型多樣性是0.877±0.000 36，核苷酸多樣性0.005 6；DSH群體共66尾，16個單倍型，261個多態(tài)性位點，單倍型多樣性是0.855±0.001 07，核苷酸多樣性是0.047 2；TH群體共69尾，8個單倍型，54個多態(tài)性位點，單倍型多樣性是0.639～0.912，核苷酸多樣性是0.005 2～0.087 4。CJ群體的遺傳多樣性最高，CYH群體次之，DSH群體和TH群體最低(表1)。

表1 基于COI基因序列的4個群體遺傳多樣性Tab.1 Genetic diversity of four populations based on COI gene sequences

由MEGA7.0.26軟件中的Data-distance計算出的4個地理群體的遺傳距離(表2)，種內遺傳距離的范圍是0.01～0.04(對角線黑體加粗)，其中TH群體的種內遺傳距離是0.01，CJ群體的種內遺傳距離最大，是0.04。4個群體的種間遺傳距離0.086～0.153，TH群體和CJ群體的種間遺傳距離最遠是0.153。群體間的遺傳距離由大到小依次是CJ-TH>CYH-TH>CJ-DSH>DSH-TH>CYH-DSH>CJ-CYH(表3)。

表2 基于COI基因序列的不同翹嘴鲌群體遺傳距離Tab.2 Pairwise genetic distances of different C.alburnus populations based on COI gene sequences

表3 基于COI基因序列的4個群體間的遺傳分化參數Tab.3 Four populations genetic differentiation parameters based on COI gene sequences

翹嘴鲌4個不同地理群體基因流和遺傳分化指數如表4所示，兩兩群體間的遺傳分化指數范圍為0.015 9～0.249 3?；蛄髦档姆秶鸀?.772 3～15.473，其中CJ和TH群體的基因流值最小(0.7723)，CJ與CYH群體的基因流值最大(15.473)。AMOVA分析結果表明，來自于群體間的遺傳變異(10.16%)遠遠低于翹嘴鲌群體內的遺傳變異(89.84%)(表5)。

表4 基于COI基因序列的不同翹嘴鲌群體基因流與遺傳分化指數Tab.4 Gene flow and genetic differentiation index of different C.alburnus populations based on COI gene sequences

表5 基于COI基因序列的分子方差分析Tab.5 Analysis of molecular variance(AMOVA) based on COI gene sequences

293個翹嘴鲌個體共有43個單倍型，14個共享單倍型，其中Hap1在CJ群體、CYH群體和TH群體共享，Hap2、Hap5和Hap10在CJ和TH群體中共享，Hap3、Hap4和Hap6在4個群體中共享，Hap7在CJ群體、DSH群體和TH群體中共享，Hap8在CJ群體和DSH群體中共享，Hap9在CJ、CYH和DSH群體中共享，Hap12 和Hap19在CYH和DSH群體中共享，Hap13 和Hap14在CYH和TH群體中共享，其余29個單倍型分別在3個地理群體中獨有，占單倍型總數的67.44%， Hap11、Hap15～Hap18和Hap20在CYH群體中特有，Hap21～Hap27是DSH群體特有，Hap28～Hap43是TH群體特有(表6)。

應用MEGA7.0.26軟件對293個翹嘴鲌個體的COI的序列進行聚類分析，得出4個翹嘴鲌群體43個單倍型的系統(tǒng)進化樹(圖2)。不同地理來源的單倍型總共分成2個大分支，不同地理群體的單倍型交叉散亂分布。

圖2 基于線粒體 COI基因序列構建鄰接系統(tǒng)進化樹Fig.2 NJ molecular phylogenetic tree based on COI gene sequences

2.3 群體歷史動態(tài)分析

翹嘴鲌4個群體的中性檢驗結果顯示，CJ群體、TH群體和DSH群體的Tajima′sD均為負值，且DSH群體和TH群體差異顯著(表1)，CJ群體和DSH群體FuLiF均為負值，且DSH群體差異顯著。用DNASPv5軟件分析得到錯配分布圖，圖中觀測值表現出多峰狀態(tài)(圖3)。

圖3 基于 COI基因序列的翹嘴鲌群體核苷酸不匹配分析Fig.3 Nucleotide mismatch analysis in the C.alburnus populations based on COI gene sequences

3 討論

3.1 不同群體翹嘴鲌的遺傳多樣性

本研究中COI序列中堿基A、T、C和G的平均含量分別為 26.3%、28.7%、26.8%和18.2%，其中T堿基含量最高，G堿基含量最低，與汪曦等[18]的研究結果一致，且A+T的平均含量(55%)高于 C+G的平均含量(45%)，與施文瑞等[19]的研究結果一致，符合脊椎動物線粒體DNA的特點[20]。

在293個翹嘴鲌個體共有43個單倍型，每個群體特有的單倍型有29個，占單倍型總數的67.44%，不同地理群體享有較多的特有單倍型，說明可能蘊藏著較大的進化潛能和更豐富的種質資源[21]。小規(guī)模魚類群體快速擴張后其群體通常表現為高的單倍型和中或低的核苷酸多樣性[19]。本研究中4個群體均表現高的單倍型多樣性和高的核苷酸多樣性，說明這些水域的翹嘴鲌群體可能沒有受到環(huán)境壓力的影響。翹嘴鲌群體中性檢驗Tajima′sD為負值，但差異不顯著，加之整體的錯配分布圖是多峰[21]，因此推測該翹嘴鲌群體沒有經歷種群擴張。

由Grant等[21]的研究可知，單倍型多樣性與核苷酸多樣性的臨界值分別為0.5和0.005，值越大則表明遺傳多樣性越高。本研究中4個翹嘴鲌群體均表現出高的遺傳多樣性(0.851) 和高的核苷酸多樣性(0.057 0)。這一結果與王丹等[8]利用線粒體COI基因序列研究的三峽庫區(qū)鲌屬魚類具有高的核苷酸多樣性0.030 1(Pi>0.005)和較高的單倍型多樣性0.986 9(Hd>0.5)一致，與黃小彧[13]的結果(Hd為0.866，Pi為0.003 30) 存在差異，造成這種差異的原因可能是不同群體翹嘴鲌的種質資源狀況不同所致[14]。本研究結果與楊子拓等[22]研究珠江翹嘴鲌的遺傳多樣性結果一致(Hd為0.875 1，Pi為0.007 0)，都表現出較豐富的遺傳多樣性。

太湖水域地理位置優(yōu)越，然而到20世紀80年代以來，太湖水體富營養(yǎng)化嚴重，翹嘴鲌等漁獲物產量下降，隨著水域保護強度的增大，增殖放流等措施的開展，太湖魚類資源有一定程度的增加[15]。本研究表明，太湖翹嘴鲌群體遺傳多樣性高于前期的研究結果[23]。自2006年，漁業(yè)主管部門對淀山湖持續(xù)進行翹嘴鲌增殖放流等漁業(yè)資源保護措施，其資源量明顯增加[24]，其遺傳多樣性水平也一直保持較高水平。2018年長漾湖被列為第三批國家級水產種質資源保護區(qū)，翹嘴鲌成為該水域禁捕保護對象之一，加大魚類保護力度是保護魚類遺傳多樣性的主要方法[25]?？梢姡茖W的漁業(yè)資源增殖放流和合理的資源保護策略可以有效地提高物種的遺傳多樣性水平。

3.2 群體遺傳分化分析

遺傳分化系數(Fst)是反映群體間遺傳分化程度的重要指標[26,27]，較高水平的Fst表明群體間具有較高水平的遺傳分化，Fst為0～0.05時為低度分化，0.05～0.15為中度分化，0.15～0.25為高度分化。本研究中4個不同的地理群體的兩兩群體之間的Fst均為正值(0.015 9～0.249 3)，CJ群體和CYH群體之間(Fst=0.015 9)與CYH群體和DSH群體間(Fst=0.036 5<0.05)，呈現低度遺傳分化；DSH群體與CJ群體之間(Fst=0.066 6)和DSH群體與TH群體之間(Fst=0.092 7)呈現中度分化，TH群體與其它群體之間遺傳分化指數較大，介于0.0927～0.2493，但不存在顯著性差異。從地圖上看，4個水域的相對距離較近但不能形成頻繁的基因交流，結合翹嘴鲌4個群體的遺傳距離結果分析可見，地理距離與遺傳距離沒有明顯的相關關系[28]。

3.3 翹嘴鲌的保護管理

本研究中長江流域江蘇段及其下游湖泊的翹嘴鲌不同群體，遺傳多樣性程度較高，每個群體都可作為一個保護單位。對比其他有關翹嘴鲌的遺傳多樣性研究，本研究為第一次對上述水域翹嘴鲌種群進行多樣性檢測，尚不能準確界定近年來人工捕撈和增殖放流對其遺傳多樣性的影響，因此后續(xù)研究需要進一步對長江流域較多江段和更多的典型淡水湖泊開展翹嘴鲌的資源調查和詳細的遺傳多樣性評估研究，根據遺傳多樣性的變化趨勢采取相應的保護措施。

綜上所述，本研究基于COI基因分析翹嘴鲌不同群體遺傳多樣性，結果發(fā)現4個翹嘴鲌群體均表現出豐富的遺傳多樣性，結果表明，本研究的研究水域可能蘊含較大進化潛能和豐富的翹嘴鲌種質資源，研究結果可以為今后翹嘴鲌遺傳多樣性研究和種質資源開發(fā)利用提供參考數據。然而僅選擇單個線粒體基因的分子標記和有限個體難以反映真正的群體遺傳關系，其真實親緣關系的探究仍需結合較多分子標記和樣本進行深入研究。因此，在翹嘴鲌群體遺傳結構研究中，尋找遺傳信息豐富和進化速率適宜的基因序列和可靠的分子標記方法仍是今后此項研究工作的重點任務之一。