黃家銳，郭青松，但小琴，羅福廣，黃 杰，王衛(wèi)民

(1.華中農業(yè)大學水產學院，動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，武漢 430070；2.武漢市江夏區(qū)農業(yè)綜合執(zhí)法大隊，武漢 430200；3.柳州市漁業(yè)技術推廣站，廣西柳州 545006)

中國圓田螺(Cipangopaludinachinensis)和中華圓田螺(C.cathayensis)別名田螺、螺螄和蝸螺牛，隸屬于軟體動物門(Phylum mollusca)腹足綱(Gastropoda)中腹足目(Mesogastropoda)田螺科(Viviparidae)圓田螺屬(Cipangopahudina)，廣泛分布在我國淡水水域，是重要的可食性螺類，為雌雄異體，卵胎生，雄螺通過右側觸角通過膨大彎曲并特化成雄性交接器與雌螺交配，受精卵在子宮內生長發(fā)育，仔螺成熟后通過生殖孔排出體外[1]。

精子的形態(tài)結構研究是受精生物學的一個重要內容，在一定程度上，精子的形態(tài)結構顯示了種的特征，因此，不同物種之間精子的超微結構差異不僅可以作為分類的重要依據(jù)，也可以在物種間親緣關系及分類研究中提供有利證據(jù)[2]。杜曉東[3]通過觀察合浦珍珠母貝(Pinctadafucata)、大珠母貝(P.maxima)、企鵝珍珠貝(Pteriapenguin)的精子超微結構發(fā)現(xiàn)，三種珍珠貝的精子結構均屬于典型的原始型，而在精子線粒體數(shù)量、精子核和中段體積上存在差異；此外，柯才煥等[4]比較分析了鮑科雜色鮑(Haliotisdiversicolorsupertexta)、盤鮑(H.discusdiscus)、皺紋盤鮑(H.discushannai)精子的超微結構，結果發(fā)現(xiàn)3種鮑精子超微結構如頂體、核的大小和比例及外形上存在差異，其他形態(tài)結構基本相似，即使是同種不同亞種的盤鮑與皺紋盤鮑，在精子的超微結構上仍存在差異。目前，只見嚴云志等[5]對中國圓田螺精子的發(fā)生和超微結構的報道。關于中華圓田螺精子的超微結構和兩種圓田螺超微結構的比較及活力研究尚未見報道。本實驗通過光學顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡以及計算機輔助精液分析computer-aided semen analysis(CASA)系統(tǒng)對中國圓田螺和中華圓田螺兩種圓田螺精子進行比較分析，以期為兩種圓田螺的分類及遺傳育種工作提供基礎數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用中國圓田螺和中華圓田螺于2020年7月來源于潛江市肖螺香水產食品有限公司，均為性成熟后的2齡成年個體，將中國圓田螺和中華圓田螺區(qū)分后，于華中農業(yè)大學南湖水產養(yǎng)殖基地進行暫養(yǎng)。精子保存液配方參考文獻[6]。

1.2 CASA系統(tǒng)檢測精子活力

中國圓田螺和中華圓田螺每組選三個性成熟良好的雄螺，用錘子將螺殼敲破，取出精巢，將精巢在精子保存液中剪碎，過濾殘渣后，在顯微鏡下觀察精液濃度，用精子保存液稀釋到合適的濃度，取1 μL精液置于載玻片上，加1 μL超純水激活后立刻蓋上蓋玻片計時。每個樣品重復測量三次，所得數(shù)值均為精子激活5 min內的平均值±標準差。使用CASA計算并記錄運動精子率(motile spermatozoon rate,MOT)、快速運動時間(fast exercise time,FET)、精子壽命(life span,LS)、平均曲線速度(average curvilinear velocity,VCL)、平均直線運動速度(average straight-line(rectilinear)velocity,VSL)、平均路徑速度(average path velocity,VAP)、線性指數(shù)或線性度(linearity,LIN)、直線指數(shù)(straightness,STR)、振動指數(shù)(wobble,WOB)、頭部側向運動平均振幅(amplitude of lateral head displacement,ALH)、鞭打頻率(beat-cross frequency,BCF)。

1.3 兩種圓田螺不同類型精子比例計算

在進行CASA系統(tǒng)精子活力檢測的同時，在每次重復中選取三個視野(每個視野大于30個精子)進行拍照，分別記錄典型精子、非典型大精子和非典型小精子的數(shù)量。

1.4 光學顯微鏡標本制備

分別將兩種圓田螺精巢放入裝有Bouin氏液的2 mL EP管中，充分剪碎后用細胞篩進行過濾制成精子懸濁液，取懸液涂片或滴片，干燥后先用伊紅染液染色5 min，再用吉姆薩染液染色15 min，雙蒸水沖洗后鏡檢，將獲得的光學顯微鏡標本用正置顯微鏡Olympus BX53進行拍照。

1.5 掃描電鏡標本制備

將鮮活雄螺解剖后取小塊精巢放在4 ℃下2.5%的戊二醛固定液中剪碎并過濾固定12 h。在樣品中加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4)2 mL離心清洗(1 000 r/min,5 min)3次，緩慢倒出上清液。使用30%、50%、70%、80%濃度乙醇梯度脫水10 min，90%和100%濃度乙醇梯度脫水8 min。使用乙酸異戊酯進行置換20 min。經常規(guī)臨界點干燥和離子濺射儀噴鍍鉑金膜后，置于JSM-6390LV型掃描電鏡觀察，同時進行顯微照相。

1.6 精子形態(tài)性狀測量

將光學顯微鏡和掃描電鏡拍照獲得的精子圖片通過imageJ軟件分別對典型精子的頭長、頭寬(頭部最寬處)、中尾段長(中段長+尾段長)、中段寬(中段最寬處)和非典型精子的頭長、頭寬(頭部最寬位置)、中段長、中段寬(中段最寬處)、尾段長進行測量，所得數(shù)值通過平均值±標準差表示。

1.7 透射電鏡標本制備

按1.5的方法取得固定后的精巢電鏡標本，按常規(guī)步驟進行預包埋、切塊后，用1%鋨酸固定，梯度酒精脫水，然后環(huán)氧樹脂812(Epon 812)滲透包埋，超薄切片，經鈾鉛雙重染色后，透射電鏡(日本HITACHI H-7650)下觀察、拍照。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行各組數(shù)據(jù)的組間差異分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果分析

2.1 計算機輔助精子活力分析

觀察表明，兩種圓田螺的典型精子活力較弱，極少數(shù)精子可以做短暫的前進運動，絕大部分典型精子只能在原地擺動，因而計算機輔助分析系統(tǒng)檢測不到典型精子的運動參數(shù)。兩種圓田螺非典型精子的活力較強，被激活后各運動參數(shù)統(tǒng)計值見表1，結果表明中國圓田螺非典型精子運動率與壽命分別為(83.96±0.01)%和14 h；中華圓田螺非典型精子運動率與壽命分別為(84.88±0.01)%和14 h，差異不顯著，在精子快速運動時間存在極顯著性差異。兩種圓田螺非典型精子的運動特征參數(shù)在VAP、VCL和VSL也存在極顯著性差異，BCF存在顯著性差異，其余各項參數(shù)均不存在顯著性差異。

表1 中國圓田螺和中華圓田螺非典型精子運動參數(shù)檢測Tab.1 Atypical spermatozoon motility parameters detection of C.chinensis and C.cathayensis

2.2 兩種圓田螺各精子比例

經計算，中國圓田螺典型精子與非典型精子比例為1∶3.05，其中典型精子∶非典型小精子∶非典型大精子=1∶1.39∶1.66；中華圓田螺典型精子與非典型精子比例為1∶2.77，其中典型精子∶非典型小精子∶非典型大精子=1∶1.39∶1.38。

2.3 精子形態(tài)結構差異比較

2.3.1 光學顯微鏡和掃描電鏡觀察

結果表明，根據(jù)中國圓田螺和中華圓田螺的精子形態(tài)可將圓田螺的精子分為典型精子和非典型精子兩種類型(圖1-1，2；圖2-2,6)。兩種類型精子的基本結構均包括頭部、中段和尾段三個部分，其中掃描電鏡下的典型精子頭部呈螺旋狀，從左向右螺旋，具6～7個螺旋，從第一螺旋開始至第7螺旋逐漸變粗(圖2-3)；典型精子中段也呈右旋狀態(tài)，與頭部相比螺旋凹陷較淺(圖2-4)；典型精子尾段非螺旋化，單鞭毛(圖2-4)，在末端漸漸變尖。表2結果顯示，兩種圓田螺典型精子頭部明顯大于中段和尾段，頭部與中段分界相對明顯，中段與尾段分界不明顯。通過對中國圓田螺和中華圓田螺精子的頭長、中尾段長、頭寬(頭部最寬處)和中段寬(中段最寬處)的形態(tài)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，兩種圓田螺精子的形態(tài)特征僅在中段寬處存在顯著性差異，頭長、中尾段長和頭寬差異不顯著(表2)。

圖1 精子光學顯微鏡圖Fig.1 Spermatozoona optical micrographs1：中國圓田螺精子；2：中華圓田螺精子；TS：典型精子；AS：非典型精子

圖2 精子涂片掃描電鏡Fig.2 Scanning electron microscope of spermatozoon smear1：精巢；2，3，4：典型精子；5，6，7，8：非典型精子；TS：典型精子；AS：非典型精子；H：精子頭部；MP：精子中段；T：精子尾段

表2 中國圓田螺和中華圓田螺典型精子形態(tài)學數(shù)據(jù)Tab.2 Morphological data of typical spermatozoon of C.chinensis and C.cathayensis μm

中國圓田螺和中華圓田螺非典型精子可分為兩種不同形態(tài)的精子，即非典型大精子和非典型小精子。兩種圓田螺非典型精子頭部呈橢圓柱狀，頭部與中段分界明顯；中段呈棒狀，表面凹凸不平，散布著許多形狀不規(guī)則的小孔；尾段由9～16條鞭毛組成，整體呈掃帚狀。通過對兩種圓田螺非典型大、小精子的形態(tài)性狀數(shù)據(jù)進行比較分析，表3結果發(fā)現(xiàn)，中國圓田螺和中華圓田螺的非典型大精子和非典型小精子在頭寬(頭部最寬處)、中段長、頭長、中段寬(中段最寬處)和尾長5個形態(tài)指標中均存在極顯著性差異；兩種圓田螺的非典型大精子與兩種圓田螺的非典型小精子在頭寬和中段寬兩個形態(tài)指標均存在顯著性差異，其余頭長、中段長和尾長不存在顯著性差異(表3)。

表3 中國圓田螺和中華圓田螺非典型精子形態(tài)學數(shù)據(jù)Tab.3 Morphology data of atypical spermatozoon of C.chinensis and C.cathayensis μm

2.3.2 透射電鏡觀察

透射電鏡觀察顯示兩種圓田螺成熟的典型精子頭部主要成分為細胞核，細胞核顆粒狀，核質分布均勻，細胞核外周質膜覆蓋，膜與核之間有一定空隙，在細胞核基部中央位置凹陷長度0.80～0.86 μm，鞭毛軸絲從凹陷處延伸至尾段末端，頭部與中段連接處有一個致密的環(huán)狀結構(圖3-1，3；圖4-1，2，3)。頭部與中段分界明顯，連接處橫切呈三角狀，細胞膜與線粒體之間也存在一定的空隙，螺旋化線粒體包裹著軸絲(圖3-5；圖4-3，4)。兩種圓田螺典型精子的尾段無線粒體結構，由細胞膜、糖原顆粒以及軸絲組成，尾段軸絲是典型的“9+2”型結構(圖3-3，5；圖4-4，5)。

兩種圓田螺非典型精子頭部主要由9～16根軸絲和細胞核組成，細胞核主要位于軸絲的外周，呈馬蹄形，核內染色質較少，為顆粒狀，染色質之間有一定的間隙，頭部質膜與細胞核，細胞核與軸絲之間結合緊密(圖3-6，7；圖4-6)。頭部與中段分界明顯，連接處可見細胞核與糖原顆粒，連接緊密，中段由細胞膜、軸絲、大量囊泡和1～3個線粒體組成，線粒體出現(xiàn)在中段中央的后半部分(圖3-8，9，10；圖4-7)。軸絲在尾部分叉，并延伸出9-16根鞭狀結構，由軸絲、單層糖原顆粒和細胞膜組成，橫切鞭狀結構，軸絲為典型的“9+2”型結構(圖3-8，11，12；圖4-7，8，9)。

圖3 中國圓田螺精子透射電鏡圖Fig.3 Spermatozoon transmission electron microscopy of C.chinensis1：中國圓田螺典型精子頭部和中段連接處，示螺旋狀細胞核和線粒體；2：縱切中國圓田螺典型精子中段及線粒體；3：縱切中國圓田螺典型精子中段和尾段及頭段和中段連接處；4：橫切中國圓田螺典型精子頭段、中段及斜切頭段和中段連接處；5：橫切中國圓田螺典型精子中段線粒體和尾段糖原顆粒；6：縱切中國圓田螺非典型精子頭部和中段連接處；7，8：縱切中國圓田螺非典型精子中段、中段線粒體及尾段鞭毛；9，10：橫切中國圓田螺非典型精子中段線粒體；11：橫切中國圓田螺非典型精子雙層糖原顆粒，示軸絲的“9+2”微管結構；12：橫切中國圓田螺非典型精子雙層糖原顆粒消失。H：頭部；MP：中段；T：尾段；N：細胞核；M：線粒體；GG：糖原顆粒

圖4 中華圓田螺精子透射電鏡圖Fig.4 Spermatozoon transmission electron microscopy of C.cathayensis1：縱切中華圓田螺典型精子頭部；2，3：縱切中華圓田螺典型精子頭部和中段；4：縱切中華圓田螺典型精子中段和尾段連接及橫切中段線粒體；5：橫切中華圓田螺尾段雙層糖原顆粒；6：橫切中華圓田螺非典型精子頭部和中段；7，8：縱切中華圓田螺非典型精子中段和尾段鞭毛及橫切中段線粒體；9：橫切中華圓田螺非典型精子尾段雙層糖原顆粒，示鞭毛“9+2”微管結構。H：頭部；MP：中段；T：尾段；N：細胞核；M：線粒體；GG：糖原顆粒

3 討論

3.1 精子活力比較分析

CASA系統(tǒng)是評估精子運動特征的定量方法，Cosson等[7]首次應用計算機輔助精液分析系統(tǒng)對水產動物的精子運動進行了描述。隨著該技術的發(fā)展和成熟，CASA系統(tǒng)在魚類和軟體動物精子運動特性檢測中得到廣泛運用[8-9]。本研究應用CASA系統(tǒng)對中國圓田螺和中華圓田螺的精子活力進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)，兩種圓田螺的非典型精子具有較強的運動能力，在兩種圓田螺非典型精子的快速運動時間上，中國圓田螺非典型精子的運動參數(shù)VAP、VCL和VSL都要顯著高于中華圓田螺非典型精子，表明在快速運動時間上，中國圓田螺非典型精子的運動能力和狀態(tài)較中華圓田螺非典型精子都要好，然而，觀察發(fā)現(xiàn)，快速運動時間過后，中國圓田螺非典型精子的運動速度急劇下降，變化明顯，而中華圓田螺非典型精子的運動速度下降緩慢，變化不明顯，仍保持著較劇烈的運動。中國圓田螺和中華圓田螺的典型精子的運動能力均差于非典型精子，兩種圓田螺典型精子只有少部分能做前進運動，且進行運動時間很短，大部分典型精子只能在原地保持劇烈的抖動狀態(tài)。此外，兩種圓田螺的精子在激活8 h后，大部分非典型精子已停止運動或抖動，而大部分典型精子仍在原地保持著抖動的劇烈狀態(tài)；14 h后，非典型精子基本死亡，典型精子仍有一部分在抖動。一般來說，精子保持活動的時間越長，可以生育的時間就越長，精子運動的能力決定著生育能力[10]。因此保持精子較高的活力和持續(xù)時間對確保受精成功至關重要。

3.2 精子形態(tài)結構差異比較

中國圓田螺和中華圓田螺均屬于圓田螺屬，兩種圓田螺的典型精子和非典型精子在外形上非常相似，通過對兩種圓田螺精子的超微結構進行比較分析，在典型精子中段寬，非典型大精子和非典型小精子的中段寬和頭寬上，中國圓田螺均顯著大于中華圓田螺；中國圓田螺或中華圓田螺非典型大精子的中段長和尾段長幾乎是非典型小精子的兩倍，頭長和頭寬比較接近；此外，中華圓田螺非典型大精子頭寬與中國圓田螺非典型小精子頭寬基本一致。這與楊曉芬等[11]對中華圓田螺與銅銹環(huán)棱螺非典型精子形態(tài)研究結果相似，兩者非典型精子僅在體寬之間有差異；蔡英亞等[12]認為前鰓類軟體動物的典型精子和非典型精子在同一個體內數(shù)目大致相等，并指出非典型精子有大、小兩種類型。但周永燦[13]在耳河螺(Rivalariaauriculata)中發(fā)現(xiàn)典型精子與非典型精子的比例為1∶5，并沒有發(fā)現(xiàn)其非典型精子的大小存在明顯差異；在本研究中，中國圓田螺和中華圓田螺典型精子和非典型精子的比例分別為1∶3.05和1∶2.77，并且在非典型精子中發(fā)現(xiàn)了大小兩極分化的現(xiàn)象。內部結構上，中國圓田螺成熟典型精子核基部凹陷長度約0.68～0.86 μm，中華圓田螺凹陷長度約0.6～0.8 μm，橫切非典型精子中段時，可見中國圓田螺1～3個線粒體，中華圓田螺1～2個線粒體。Franzén[14]認為腹足類動物線粒體數(shù)目和形態(tài)相對穩(wěn)定，種與種之間的線粒體數(shù)量變化不大，但仍有差異；即使是在親緣關系很近的兩個同種不同亞種的盤鮑中，精子的超微結構上仍有差異?？虏艧ǖ萚15]也認為精子的超微形態(tài)結構可以作為區(qū)分種與種、不同亞種的輔助依據(jù)。

3.3 典型精子

不同物種間的軟體動物精子在形態(tài)結構上存在較大差異，根據(jù)受精方式將軟體動物典型精子分為原始型精子和進化型精子兩種，原始型精子頭部呈錐形、卵圓形[16]，具頂體，核短，中段較短，無線粒體鞘結構，存在于體外受精較低等的種類；進化型精子頭部呈線狀[17]、錐形[18]或紡錘形[19]，多數(shù)無頂體或頂體退化，核延長，中段加長，有線粒體拉長形成的線粒體鞘結構，存在于體內受精較高等的種類。根據(jù)圓田螺受精的方式以及典型精子的形態(tài)結構，認為中國圓田螺和中華圓田螺典型精子屬于修飾型精子，中國圓田螺和中華圓田螺頭部呈螺旋形，無頂體結構，細胞核高度濃縮并螺旋化，同時具有螺旋化的線粒體。頂體是否存在，反映了其受精過程的特點，Thompson等[20]對后鰓亞綱海兔屬軟體動物進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)精子無需復雜的頂體結構可以直接與卵膜接觸；頂體通常結構簡單甚至消失的淡水蚌類如褶紋冠蚌(Cristariaplicata)[21]、三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)[22]中，在進行受精時，精子也無需經過復雜的頂體反應就可通過膠質卵膜入卵；中國圓田螺和中華圓田螺的精子無頂體結構可能與精子頭部螺旋化和染色質凝聚方式有關，高度濃縮的核內染色質以及核的延長并螺旋化有可能利于圓田螺精子快速穿過卵膜，無需進行復雜的頂體反應，另外，螺旋形線粒體拉長形成線粒體鞘包繞在軸絲外，滿足了精子長時間運動的能量需要，從而提高受精率。我們認為，中國圓田螺和中華圓田螺復雜的精子結構是腹足綱動物原始精子向修飾型精子演變的重要依據(jù)，顯示了其在腹足綱中處于較高等的進化地位。

3.4 非典型精子

在許多軟體動物的精巢中，可以同時產生兩種不同類型的精子，這兩種類型通常被稱為“典型精子”和“非典型精子”[23]。Koike等[24]描述了非典型精子的起源情況，兩型精子成熟時，不同物種中的非典型精子細胞核組成不同，有的會出現(xiàn)接近正常的、減少的或無核的情況，非典型精子的形態(tài)也會相應地與典型精子不同。中國圓田螺和中華圓田螺非典型精子頭部呈橢圓柱狀，細胞核位于前端周圍，核質少，呈馬蹄狀，9～16根軸絲從頭部向尾段延伸，線粒體被軸絲包裹位于中段后部，尾段軸絲分叉，軸絲上含有大量糖原顆粒。John等[25]在海俄勒岡法螺(Fusitritonoregonensis)的研究中發(fā)現(xiàn)，其成熟的非典型精子頭部圓錐形，桿狀細胞核幾乎貫穿整個頭部，中段由細長的線粒體和5～8根軸絲構成，軸絲在尾段形成一簇短尾巴；這與巴西麥螺(Columbellamercatoria)、環(huán)帶蟹守螺(Cerithideacingulata)等腹足動物非典型精子相似，其共同特點為中段由一個或多個軸絲完全包裹在非典型精子體中，可見細長的線粒體排列在軸絲之間，有由多個鞭毛組成的“尾刷”型尾段[26]。關于非典型精子的功能，目前尚無定論，有學者認為非典型精子是精巢中無功能的副產物，不參與受精作用[27];一些則認為典型精子和非典型精子都能進入卵子，非典型精子在受精過程起到積極作用[28]；Yasuzumi[29]認為非典型精子可以結合周圍的營養(yǎng)細胞而形成較大的密致體，為發(fā)育中的典型精子細胞提供營養(yǎng)；在某些腹足動物中，典型精子可以附著在非典型精子上形成“精子器”或“可移動拆卸的陰莖”，攜帶典型精子進入卵巢內完成受精[30]。中國圓田螺和中華圓田螺的非典型精子是否像某些物種一樣具有營養(yǎng)功能或攜帶典型精子的能力，或者有其他功能，有待進一步研究。