任 煜，劉婷婷，祁冰潔

(安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽 安慶 246052)

黑色素瘤是一種惡性的侵襲性腫瘤，黑色素瘤的發(fā)生率在所有皮膚癌中最低，但死亡率高[1]。具有高度惡化、預(yù)后差、易轉(zhuǎn)移、對化療藥物不敏感等特點(diǎn)，給人類的生命健康帶來極大的威脅[2]。人參皂苷Rh2(G-Rh2)是人參皂苷中抗腫瘤活性較強(qiáng)的物質(zhì)之一，在治療肝癌、結(jié)腸癌、肺癌及胃癌等方面都表現(xiàn)出藥理作用[3]，但是在黑色素瘤的治療上鮮少有人報(bào)道。本研究選用小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16作為研究對象，考察G-Rh2對B16細(xì)胞的作用, 并初步探討其中的機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；G-Rh2(純度>98%，購自成都曼思特生物科技有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶、雙抗、PBS磷酸緩沖鹽溶液(均購自上海碧云天科技有限公司)；胎牛血清、CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒、DNA含量檢測試劑盒、Bradford法蛋白濃度測定試劑盒、Caspase-3活性測定試劑盒、Caspase-9活性測定試劑盒(均購自上海索萊寶生物科技有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)。

1.1.2 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo 公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus 公司)；JW-2019HR高速冷凍離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；CytoFLEX流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)；SpectraMax iD3多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將裝有黑色素瘤B16細(xì)胞的凍存管從液氮中取出，迅速投入37 ℃水浴融化，來回晃動至細(xì)胞融化后盡快移出37 ℃水浴。然后置于離心機(jī)中，1000 rpm離心5 min，棄去上清液，加入適量的完全培養(yǎng)基重懸，把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入含有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，放入CO2培養(yǎng)箱(37 ℃，5%CO2)培養(yǎng)，顯微鏡下密切觀察細(xì)胞狀態(tài)，1～2 d更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞培養(yǎng)至融合率達(dá)到80%～90%后，棄去培養(yǎng)基，加入適量PBS清洗，加入胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的黑色素瘤B16細(xì)胞，在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞的濃度調(diào)整為1×105個(gè)/mL，隨后將細(xì)胞接種到96孔板中，每孔加入100 μL的細(xì)胞液，每孔細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/孔，在培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁生長后，棄上清，在96孔板中分別加入含藥的100 μL新鮮完全培養(yǎng)基，藥物的濃度分別為10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL，同時(shí)設(shè)有未加藥的空白對照組，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，將96孔板中的培養(yǎng)液吸棄，加入含CCK-8的混合液(CCK-8試劑和完全培養(yǎng)液的體積稀釋比例為1∶10)，37 ℃繼續(xù)孵育1 h后，在酶聯(lián)免疫檢測儀波長450 nm處檢測各孔的OD值，并計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。計(jì)算公式為：

增殖抑制率=[1-(藥物組OD值-空白組OD值/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長的黑色素瘤B16細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞接種于6孔板中，在37 ℃，5% CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。細(xì)胞貼壁生長后，棄培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，更換含藥的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，將其分5組：空白對照組、10 mg/mL組、20 mg/mL組、30 mg/mL組、40 mg/mL組。藥物處理48 h后，用胰蛋白酶消化，PBS沖洗3次，然后加入1 mL冷PBS洗滌，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，1000 rpm，4 ℃離心5 min，棄上清，重復(fù)3次；將細(xì)胞懸浮于1 mL Binding Buffer，300 g離心10 min，棄上清，再用1 mL Binding Buffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/mL；每管加入100 μL的細(xì)胞(1×105個(gè)/mL)，然后每管加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)10 min；5 μL PI，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，加400 μL Binding Buffer，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞凋亡率/%=早期凋亡率/%+晚期凋亡率/%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 取對數(shù)生長的黑色素瘤B16細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞接種于6孔板中，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，細(xì)胞貼壁生長后，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，更換含藥的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，將其分5組：空白對照組、10 mg/mL組、20 mg/mL組、30 mg/mL組、40 mg/mL組。藥物處理48 h后，細(xì)胞用胰蛋白酶消化，PBS洗滌3次，將細(xì)胞濃度調(diào)整為(1～5)×106個(gè)/mL，取1 mL的細(xì)胞懸液離心，1000 g，離心3min；棄上清，70%預(yù)冷酒精混勻，4 ℃固定12～24 h。1000 g，離心3 min，去上清，1 mL PBS洗滌1次，1000 g，離心3 min，去上清。加入0.5 mL碘化丙啶染色液(染色緩沖液、RNaseA、碘化丙啶染色液以500:25:2.5配制為碘化丙啶染色液)，37 ℃避光孵育30 min，4 ℃避光孵育30 min，用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 分光光度法檢測Caspase-3、Caspase-9活性 用顯微鏡對黑色素瘤B16細(xì)胞的生長情況進(jìn)行觀察，取對數(shù)生長的黑色素瘤B16細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，將其分5組：空白對照組、10 mg/mL組、20 mg/mL組、30 mg/mL組、40 mg/mL組。藥物處理48 h后，用胰蛋白酶消化，將細(xì)胞濃度調(diào)整為(1～5)×106個(gè)/mL，300 g，離心5 min，去上清，用PBS重懸，300 g，離心3 min，加入Lysis Buffer，在冰上孵育15 min，10000 g，離心1 min，通過Bradford法定量蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整樣品蛋白濃度為1.0 mg/mL。每組取50 μL的樣品蛋白，加入Caspase-3或Caspase-9 Substrate，37 ℃避光孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測405 nm的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用藥物組與未加藥對照組的吸光度(OD)值來表示不同濃度藥物組Caspase-3和Caspase-9的活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，用Graphpadprism 7進(jìn)行做圖。計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 G-Rh2對B16細(xì)胞增殖的影響不同濃度G-Rh2 (10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL)作用于B16細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，與空白對照組比，隨給藥濃度升高和藥物干預(yù)時(shí)間延長B16細(xì)胞的細(xì)胞活力均有顯著降低，并且呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性，見表1?？梢?，G-Rh2具有抗B16黑色素瘤細(xì)胞的潛在能力，值得進(jìn)一步深入研究。

表1 在不同時(shí)間段下不同濃度G-Rh2作用于B16細(xì)胞的生長抑制率

2.2 G-Rh2對B16細(xì)胞凋亡的影響10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL的G-Rh2作用B16細(xì)胞48 h后，與對照組相比，G-Rh2的10 mg/mL組B16細(xì)胞凋亡率沒有顯著的差異(P>0.05)，G-Rh2的其他各組能顯著誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡，隨著濃度的增加，細(xì)胞凋亡率也在增加(P<0.05)，呈濃度依賴性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。明確了G-Rh2能夠誘導(dǎo)B16黑色素瘤細(xì)胞凋亡。

圖1 不同濃度的人參皂苷Rh2對B16細(xì)胞凋亡的影響

2.3 G-Rh2對B16細(xì)胞周期的影響10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL的G-Rh2作用B16細(xì)胞48 h后，不同濃度G-Rh2均可影響B(tài)16細(xì)胞生長周期，與空白對照組相比，G0/G1期細(xì)胞增多，由空白對照組60.64%增加至40 mg/mL時(shí)的82.88%，G2/M期細(xì)胞減少，由空白對照組16.31%下降至40 mg/mL時(shí)的7.49%，見表2、圖2。G-Rh2誘導(dǎo)B16細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。隨著G-Rh2濃度的增加，這種作用越顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 不同濃度G-Rh2作用下B16細(xì)胞48 h后細(xì)胞周期分布情況

圖2 不同濃度G-Rh2作用于B16細(xì)胞48 h后細(xì)胞周期分布情況

2.4 G-Rh2對B16細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性的影響隨著G-Rh2濃度的上升，Caspase-3、Caspase-9活性均明顯升高，且呈劑量依賴性，各組細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9活性與Control組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。表明G-Rh2能夠活化Caspase-3和Caspase-9，從而參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

表3 不同濃度G-Rh2作用B16細(xì)胞48 h后caspase-3，caspase-9活性

3 討論

惡性黑色素瘤，多見于皮膚，是一種侵襲性很高的腫瘤，而且對于大多數(shù)傳統(tǒng)的治療方法都會產(chǎn)生抵抗能力。目前治療黑色素瘤的方法眾多,但其預(yù)后很差[4]，多數(shù)藥物在治療過程中反應(yīng)率低且毒性非常顯著，所以大多數(shù)常規(guī)化療藥物在黑色素瘤治療中都失敗[5]。因此，迫切需要尋找一些新的有效安全的黑色素瘤藥物。

在20世紀(jì)60～70年代人們就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并且認(rèn)識到人參具有抗腫瘤的作用，能夠抑制某些惡性腫瘤。隨著大量的研究證明，人參中具有抗腫瘤作用的活性成分主要是人參皂苷類。人參皂苷主要存在于人參、三七等五加科人參屬植物中，是一類固醇類化合物[6]。G-Rh2 是從人參中提取分離得到的二醇型低糖鏈皂苷單體, 它具有抗炎、抗腫瘤及降血糖作用等作用[7]，G-Rh2 對癌癥患者病情的改善、生活質(zhì)量的提高、生命的延長等都具有重要作用。G-Rh2對很多種腫瘤細(xì)胞都具有抑制作用，像肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等。隨著國內(nèi)外研究的深入，學(xué)者發(fā)現(xiàn)G-Rh2主要是通過多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡分化；能夠提高機(jī)體對腫瘤的免疫力，增強(qiáng)免疫活性；抵抗腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲；抑制腫瘤血管的形成等[8]方面來產(chǎn)生抗腫瘤的作用。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用CCK-8檢測不同濃度的G-Rh2對B16細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，隨G-Rh2濃度升高和G-Rh2干預(yù)時(shí)間延長，與空白對照組比，對B16細(xì)胞的抑制率均有顯著升高，并且呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性。表明G-Rh2能夠抑制B16細(xì)胞增殖，說明G-Rh2具有抗B16黑色素瘤細(xì)胞的潛在能力。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是治療腫瘤非常重要的途徑之一，腫瘤細(xì)胞凋亡是為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，由基因表達(dá)調(diào)控的細(xì)胞自主有序的死亡。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移都與腫瘤細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系[9]。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，它的細(xì)胞體積會縮小，細(xì)胞核的核質(zhì)會發(fā)生濃縮、核仁碎裂、深染，凋亡小體等變化。本實(shí)驗(yàn)采用Annexin V-FITC/PI雙染的方法，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測G-Rh2對B16細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響，與空白對照組相比，隨著G-Rh2的濃度增加，B16細(xì)胞的凋亡率也升高，呈濃度依賴性。表明G-Rh2能夠顯著增加B16細(xì)胞的凋亡率，說明G-Rh2能夠誘導(dǎo)B16黑色素瘤細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞周期阻滯是誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制之一，細(xì)胞的凋亡與其周期變化密切相關(guān)，細(xì)胞周期的全過程受到G1、S、G2、M等檢查點(diǎn)的嚴(yán)格控制，當(dāng)這些檢查點(diǎn)發(fā)生改變就會導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，并且向癌癥發(fā)生發(fā)展，這些檢查點(diǎn)出現(xiàn)缺陷會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限增殖。很多抗腫瘤細(xì)胞能夠在在特定的檢測點(diǎn)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測G-Rh2對B16細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，不同濃度G-Rh2均可影響B(tài)16細(xì)胞生長周期，與空白對照組相比，G0/G1期細(xì)胞增多，G2/M期細(xì)胞減少，隨著G-Rh2濃度的增加，這種作用越顯著，表明G-Rh2誘導(dǎo)B16細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。

Caspase家族存在于細(xì)胞質(zhì)的溶膠中，是一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的半胱氨基酸家族，也是促進(jìn)凋亡的關(guān)鍵酶。大多數(shù)細(xì)胞凋亡通路都會匯合成一個(gè)可激活的Caspase的中心死亡信號，除少數(shù)非Caspase依賴性的通路[11]。Caspase家族中Caspase-9，Caspase-3在凋亡中具有重要的地位，Caspase-9是重要的啟動分子，Caspase-9位于凋亡級聯(lián)反應(yīng)的上游，它可以自我活化或者與其他Caspase相互活化，激活下游的其他Caspase蛋白并且起著逐級放大作用，從而啟動凋亡[12]。Caspase-3是重要的執(zhí)行分子，當(dāng)接受信號后啟動凋亡。終末效應(yīng)酶Caspase-3無論是哪一種途徑都將被激活，產(chǎn)生一系列級聯(lián)反應(yīng)，促使細(xì)胞凋亡，所以說Caspase-3有“死亡蛋白酶”之稱[13]。本實(shí)驗(yàn)采用分光光度法檢測Caspase-9、Caspase-3蛋白的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，隨著G-Rh2濃度的升高，Caspase-9、Caspase-3活性也越來越高，且呈劑量依賴性。G-Rh2可能是通過激活Caspase家族，干預(yù)了Caspase-9、Caspase-3蛋白活性，促進(jìn)了B16細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，G-Rh2可有效抑制黑色素瘤細(xì)胞B16的增殖，并且促進(jìn)體外培養(yǎng)的黑色素瘤細(xì)胞B16凋亡，G-Rh2誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡有可能與激活Caspase信號通路有關(guān)。這顯示了G-Rh2在惡性黑色素瘤治療中具有潛在應(yīng)用價(jià)值，但G-Rh2誘導(dǎo)凋亡的具體途徑以及藥物作用的靶點(diǎn)仍有待深入探討。