王海波，孫 鵬，李玉杰，潘慶杰，董煥聲

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 2 661091；2.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東濰坊 261061）

哺乳動(dòng)物胚胎早期發(fā)育能力取決于母源mRNA、蛋白質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)等在卵母細(xì)胞中的積累[1]，而卵母細(xì)胞質(zhì)量是影響胚胎發(fā)育能力的關(guān)鍵內(nèi)因。有研究指出，性成熟前綿羊卵母細(xì)胞的發(fā)育能力低于成年綿羊[2]，在奶牛上也有相似發(fā)現(xiàn)[3]。因此，提高體外成熟（IVM）后成熟卵母細(xì)胞的質(zhì)量是改善胚胎發(fā)育能力的先決途徑。

在排卵前卵泡中，顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的cGMP 通過間隙連接擴(kuò)散到卵母細(xì)胞中，維持減數(shù)分裂前期停滯[4]。在IVM 過程中，脫離了卵泡液環(huán)境的卵母細(xì)胞會(huì)恢復(fù)減數(shù)分裂，但卵母細(xì)胞易發(fā)生核質(zhì)成熟不同步的現(xiàn)象。據(jù)報(bào)道，延長IVM 時(shí)間可提高第一極體排出率，但I(xiàn)VM 后未受精的卵母細(xì)胞將經(jīng)歷隨時(shí)間變化的質(zhì)量老化過程[5]。卵母細(xì)胞的IVM 可通過模擬卵泡液環(huán)境來改善[6]。Zhang 等[7]通過構(gòu)建綿羊卵母細(xì)胞雙階段IVM體系（C 型利鈉肽孵育液孵育4 h，第二階段轉(zhuǎn)入成熟液IVM24 h）提高了卵母細(xì)胞發(fā)育能力。Adeldust 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，將卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞IVM 24 h 后轉(zhuǎn)移至成熟液中IVM 12 h，可顯著提高卵母細(xì)胞核成熟率和卵裂率。本研究構(gòu)建的顆粒細(xì)胞雙階段共培養(yǎng)模式為卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞預(yù)共培養(yǎng)6 h 后轉(zhuǎn)移到常規(guī)成熟液中IVM 21 h，旨在構(gòu)建顆粒細(xì)胞雙階段共培養(yǎng)模式并探究其對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞IVM 的影響，為改良性成熟前綿羊卵母細(xì)胞IVM 體系提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 促卵泡素（FSH）、促黃體素（LH）為RayBiotech 公司產(chǎn)品；雌二醇（E2）、丙酮酸鈉、表皮生長因子（EGF）、透明質(zhì)酸酶、礦物油等為Sigma公司產(chǎn)品；DME/F-12、Medium199/EBSS 為Hyclone公司產(chǎn)品；線粒體紅色熒光探針（Mito Tracker Red CMXRos）為大連美侖公司產(chǎn)品；活性氧檢測試劑盒（ROS Assay Kit）為碧云天公司產(chǎn)品。

體外成熟培養(yǎng)基：M199 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1% 青鏈霉素混合液、10% FBS、10 μg/mL FSH、10 μg/mL LH、1 μg/mL E2、2 mmol/L 丙酮酸鈉、100 ng/mL EGF。

1.2 樣品采集及預(yù)處理

1.2.1 卵母細(xì)胞的采集 性成熟前綿羊（3 月齡）卵巢采集自山東省日照市東港區(qū)的綿羊屠宰場，將采集的新鮮綿羊卵巢存放在裝有含青鏈霉素、38.5℃生理鹽水的保溫桶內(nèi)，在3 h 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用含有青鏈霉素的生理鹽水清洗卵巢數(shù)次，剪去除卵巢多余組織，采用抽吸法采集卵母細(xì)胞。用5 mL 注射器吸取1～2 mL 的38.5℃預(yù)熱的采卵液，抽取卵巢表面卵泡的卵泡液，將抽取的卵泡液注射到60 mm 的培養(yǎng)皿中。

1.2.2 卵母細(xì)胞IVM 提前向四孔板中加入500 μL 成熟液，然后放入38.5℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)熱2 h 以上。使用口吸管在體視鏡下從采卵液里挑選優(yōu)質(zhì)的卵母細(xì)胞，將卵母細(xì)胞移入洗卵液洗滌3～5 遍，隨機(jī)分成2 組，然后轉(zhuǎn)移到四孔板成熟液，放入38.5℃、5%CO2培養(yǎng)箱里分別IVM 24 h 和27 h。

1.2.3 顆粒細(xì)胞雙階段共培養(yǎng) 將培養(yǎng)到第2 代的成年綿羊顆粒細(xì)胞傳至四孔板內(nèi)，在38.5℃、5%CO2培養(yǎng)箱里用成熟液培養(yǎng)24 h 至接觸抑制。在卵母細(xì)胞IVM前更換新的成熟液，并預(yù)熱2 h 以上，然后按照上述方法收集卵母細(xì)胞并進(jìn)行體外成熟。共培養(yǎng)體系隨機(jī)分為2 組：一組在共培養(yǎng)6 h 后，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至普通成熟液中繼續(xù)IVM 18 h，共24 h；另一組在共培養(yǎng)6 h 后，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至普通成熟液中繼續(xù)IVM 21 h，共27 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 將進(jìn)行IVM 的性成熟前綿羊卵母細(xì)胞分為4 組，即對(duì)照組（常規(guī)IVM 24 h）、27 h IVM 組（常規(guī)延時(shí)IVM 27 h）、6 h pre-IVM+18 h IVM 組（預(yù)共培養(yǎng)6 h 后，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至普通成熟液中繼IVM 18 h）、6 h pre-IVM+21 h IVM 組（預(yù)共培養(yǎng)6 h 后，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至普通成熟液中繼續(xù)IVM 21 h）。

1.3.2 不同培養(yǎng)方式對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞核成熟的影響 收集4 個(gè)分組的性成熟前綿羊卵母細(xì)胞，用透明質(zhì)酸去除卵丘細(xì)胞后，觀察卵母細(xì)胞的第一極體排出情況，統(tǒng)計(jì)核成熟率。

1.3.3 不同培養(yǎng)方式對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞老化的影響 收集4 個(gè)分組的性成熟前綿羊卵母細(xì)胞，用透明質(zhì)酸去除卵丘細(xì)胞后，觀察統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞老化情況。

1.3.4 不同培養(yǎng)方式對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞線粒體分布的影響 收集4 個(gè)分組的性成熟前綿羊卵母細(xì)胞，用透明質(zhì)酸去除卵丘細(xì)胞，收集核成熟的卵母細(xì)胞，在0.01%PVA 的PBS 緩沖液中洗滌3 次，轉(zhuǎn)到400 nmol/L線粒體紅色熒光探針（Mito Tracker Red CMXRos）中37.5℃孵育30 min，洗滌3次后轉(zhuǎn)移到激光共聚焦專用皿，共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察檢測DsRed（Ex:579 nm；Em:599 nm）并采集圖像，使用Image J 軟件分析。

1.3.5 不同培養(yǎng)方式對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)ROS 水平的影響 收集4 個(gè)分組的性成熟前綿羊卵母細(xì)胞，用透明質(zhì)酸去除卵丘細(xì)胞，收集核成熟的卵母細(xì)胞，在無血清MI99 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中洗滌3 次，轉(zhuǎn)入200 μL 10 mmol/L ROS 水平檢測工作液（DCFH-DA) 中38.5℃孵育30 min，轉(zhuǎn)移到激光共聚焦專用皿，在共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察檢測FITC（Ex：495 nm，Em：519 nm）并采集圖像，使用Image J 軟件分析平均熒光強(qiáng)度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPASS 25.0 LSD 法進(jìn)行單因素方差分析（ANVOA），以P<0.05 作為差異性顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)方式對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞核成熟的影響 如表1 所示，與對(duì)照組相比，27 h IVM 組性成熟前綿羊卵母細(xì)胞的第一極體排出率顯著提高，6 h pre-IVM+18 h IVM 組顯著降低，而6 h pre-IVM+21 h IVM組無顯著變化。因此，顆粒細(xì)胞雙階段共培養(yǎng)模式不會(huì)降低卵母細(xì)胞的核成熟率。

表1 不同培養(yǎng)方式下性成熟前綿羊卵母細(xì)胞第一極體排出率

2.2 不同培養(yǎng)方式對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞老化的影響如表2 和圖1 所示，27 h IVM 組的老化率（31.00%）高于其他處理組（P<0.05）。與對(duì)照組相比，6 h pre-IVM+21 h IVM 組的老化率（17.40%）有所上升（P>0.05），低于27 h IVM 組（P<0.05）。結(jié)果表明，顆粒細(xì)胞雙階段共培養(yǎng)模式能夠降低延時(shí)IVM 對(duì)卵母細(xì)胞老化的影響。

表2 不同培養(yǎng)方式下性成熟前綿羊卵母細(xì)胞老化率

圖1 性成熟前綿羊卵母細(xì)胞老化代表圖

2.3 不同培養(yǎng)方式對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞線粒體分布的影響 如圖2-A 所示，在MII 期的綿羊卵母細(xì)胞內(nèi)有3 種線粒體分布模式：皮質(zhì)/ 核周（pericortical/perinuclear，P/P）分布（胞質(zhì)完全成熟）、均勻分布（胞質(zhì)成熟不完全）和萎縮分布（線粒體異常分布）。如圖2-B 所示，6 h pre-IVM+21 h IVM 組的皮質(zhì)/核周分布比例（56.25%）高于其他組（P<0.05），且均勻分布模式比例（32.29%）低于對(duì)照組（51.00%）（P<0.05）。因此，顆粒細(xì)胞雙階段共培養(yǎng)有利于卵母細(xì)胞線粒體的正常排布，可以促進(jìn)胞質(zhì)成熟。

圖2 不同培養(yǎng)方式對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞線粒體分布的影響

2.4 不同培養(yǎng)方式對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)ROS水平的影響 如圖3 所示，與對(duì)照組（9.00%）相比，6 h pre-IVM+21 h IVM 組卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)ROS 水平（9.78%）有所升高（P>0.05），且低于27 h IVM 組（15.24%）（P<0.05）。結(jié)果表明，顆粒細(xì)胞雙階段共培養(yǎng)能降低延時(shí)IVM 的卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)ROS 水平。

圖3 不同培養(yǎng)方式對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)ROS 水平的影響

3 討 論

顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞共培養(yǎng)，在體外可產(chǎn)生一系列抑制減數(shù)分裂及延緩核成熟的物質(zhì)。在小鼠和豬上，顆粒細(xì)胞來源的C 型利鈉肽（CNP）對(duì)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂恢復(fù)有抑制作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)階段顆粒細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂同樣有抑制作用，但預(yù)先共培養(yǎng)一段時(shí)間后，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到普通成熟培養(yǎng)基中進(jìn)行常規(guī)IVM 可解除抑制作用，使減數(shù)分裂恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)中，在預(yù)先共培養(yǎng)6 h 后，轉(zhuǎn)移到普通成熟培養(yǎng)基中IVM 21 h 的卵母細(xì)胞第一極體排出率高于繼續(xù)IVM 18 h的卵母細(xì)胞，這說明顆粒細(xì)胞雙階段共培養(yǎng)模式下，常規(guī)IVM 階段卵母細(xì)胞依然需要充足的時(shí)間去完成核成熟進(jìn)程。

線粒體是真核細(xì)胞中一個(gè)重要的細(xì)胞器，在能量代謝和ATP 生產(chǎn)中起著重要作用[10]，線粒體的活化和遷移是卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟過程中的關(guān)鍵標(biāo)志之一[11]。研究表明，包括綿羊在內(nèi)的大多數(shù)哺乳動(dòng)物的健康卵母細(xì)胞中，線粒體呈皮質(zhì)/核周分布模式，是核染色體遷移和皮質(zhì)顆粒反應(yīng)所必需的，是胞質(zhì)完全成熟的表現(xiàn)[12]。相反，線粒體分布不規(guī)則，是卵母細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷的標(biāo)志，而線粒體分布均勻，有分散的小線粒體聚集體，表明細(xì)胞沒有能力正確組織線粒體[13]。本研究結(jié)果表明，在6 h pre-IVM+21 h IVM 雙階段共培養(yǎng)模式下，線粒體呈皮質(zhì)/核周分布的性成熟前綿羊卵母細(xì)胞的比例顯著提高，這表明6 h pre-IVM+21 h IVM 顆粒細(xì)胞雙階段共培養(yǎng)模式可以使卵母細(xì)胞胞質(zhì)得到充足發(fā)育，促進(jìn)卵母細(xì)胞正確組織線粒體的遷移排布。

另外，本研究結(jié)果表明，延長IVM 時(shí)間可以有效提高性成熟前綿羊卵母細(xì)胞的核成熟率，但I(xiàn)VM 27 h卵母細(xì)胞的老化率遠(yuǎn)高于常規(guī)IVM 24 h 的卵母細(xì)胞。據(jù)報(bào)道，卵母細(xì)胞老化會(huì)導(dǎo)致卵周隙增大、透明帶硬化、胞膜空泡化、胞質(zhì)破碎以及線粒體和紡錘體等細(xì)胞器形態(tài)結(jié)構(gòu)異常[14-15]和功能紊亂。無論在體內(nèi)還是體外的卵母細(xì)胞如果長時(shí)間沒有受精，都會(huì)呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性的質(zhì)量下降并發(fā)生老化[16]。這與本研究結(jié)果一致，即IVM 27 h 卵母細(xì)胞的老化率增高，而6 h pre-IVM+21 h IVM顆粒細(xì)胞雙階段共培養(yǎng)模式可以減少性成熟前綿羊卵母細(xì)胞的老化率。由ROS 組成的自由基是氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物，卵母細(xì)胞的老化伴隨著氧化應(yīng)激的過度積累，老化的卵母細(xì)胞容易發(fā)生凋亡或胚胎發(fā)育遲緩[17]。本研究結(jié)果顯示，延長IVM 時(shí)間會(huì)使卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)ROS 水平顯著升高，相應(yīng)地，卵母細(xì)胞的老化率也隨之上升，原因可能是隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，胞質(zhì)內(nèi)ROS 不斷積累，導(dǎo)致包括線粒體為主的諸多細(xì)胞器受到ROS 的誘導(dǎo)損傷[18]，造成卵母細(xì)胞的老化凋亡。與IVM27 h 的卵母細(xì)胞相比，6 h pre-IVM+21 h IVM 顆粒細(xì)胞雙階段共培養(yǎng)模式有可以抑制性成熟前卵母細(xì)胞胞質(zhì)ROS 水平升高的趨勢。

目前，顆粒細(xì)胞雙階段共培養(yǎng)模式對(duì)抑制ROS 水平升高和促進(jìn)線粒體成熟分布的具體機(jī)制尚不清楚，下一階段的研究計(jì)劃探究顆粒細(xì)胞雙階段共培養(yǎng)模式對(duì)體外成熟影響的具體機(jī)制以及對(duì)性成熟前綿羊早期胚胎發(fā)育的影響。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6 h pre-IVM+21 h IVM 顆粒細(xì)胞雙階段共培養(yǎng)模式并不抑制性成熟前綿羊卵母細(xì)胞的核成熟，但常規(guī)成熟階段IVM 時(shí)間不足會(huì)抑制第一極體的排出。同時(shí)，此雙階段共培養(yǎng)模式下，有利于性成熟前綿羊卵母細(xì)胞線粒體的正確遷移分布，能夠促進(jìn)核質(zhì)成熟同步，并通過抑制卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)ROS 水平升高，減緩卵母細(xì)胞的老化率。