肖 成，王 晶,2，薛佳佳,3，柳儉強，于永生，張立春，馬惠海，金海國*，曹 陽*

（1.吉林省農業(yè)科學院，吉林公主嶺 136100；2.延邊大學農學院，吉林延吉 133000；3.吉林農業(yè)大學動物科技學院，吉林長春 130000）

優(yōu)質羊肉越來越受到消費者的歡迎，而提高肌內脂肪含量能夠提升羊肉品質。遺傳因素是影響肌內脂肪含量的重要因素之一，但參與調控綿羊脂肪細胞分化過程的基因及通路錯綜復雜。本文著重研究Wnt/β-catenin信號通路關鍵基因在綿羊脂肪細胞分化過程中的變化規(guī)律。這為研究參與綿羊脂代謝并與Wnt/β-catenin 信號通路相關的作用基因提供有價值的參考。Wnt 信號通路能夠調節(jié)個體生長，參與機體多方面發(fā)育，是維持器官穩(wěn)態(tài)的著名信號通路。目前，科研人員研究Wnt/β-catenin 信號通路主要圍繞細胞增殖、腫瘤、疾病、神經、繁殖等方面進行[1]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin 參與脂肪細胞分化，發(fā)揮重要作用[2]。目前，在人、小鼠、豬以及牛上關于Wnt/β-catenin 信號通路的研究較多[3]，但在綿羊上，Wnt/β-catenin 信號通路關鍵基因如何變化仍沒有系統(tǒng)研究。因此，本實驗以此為切入點，探索Wnt/β-catenin 信號通路關鍵基因在綿羊脂肪細胞分化過程中的變化規(guī)律，旨在為Wnt/β-catenin信號通路在綿羊脂代謝方面的研究提供有價值參考，為尋找與綿羊脂代謝相關的作用基因提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗選擇2 月齡雄性綿羊1 只，由吉林省農業(yè)科學院動物生物技術研究所飼養(yǎng)。人道處死后，無菌取腹溝處白色脂肪組織，用于分離前體脂肪細胞。

1.2 實驗材料 分離細胞所用胰酶、膠原酶II 來自Sigma 生物公司；細胞培養(yǎng)皿來自Corning 公司；胎牛血清來自Gemini 生物公司；PBS 緩沖液、DMEM-F12培養(yǎng)基、雙抗來自賽默飛生物公司；細胞分化誘導劑如（胰島素、地塞米松、IBMX）等均來自Sigma 公司；RNA 提取試劑TRIzol 來自Invitrogen 公司；PCR 預混酶來自康為世紀生物公司；反轉錄試劑盒、DL2000 Maker 購自TaKaRa 生物有限公司；PCR 引物及測序服務由蘇州金唯智生物科技有限公司提供；LightCycler 480 SYBR Green I Master 由羅氏（中國）公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 綿羊前體脂肪細胞分離 用含有1%雙抗的PBS 清洗干凈白色脂肪組織，無菌鑷子剔除脂肪組織中筋膜及血塊，手術剪刀將組織剪成1 mm3小塊。組織塊用膠原酶II 浸泡并置于37℃水浴鍋內消化1 h，每5 min 混勻一次，消化后液體經200 目及400 目濾網過濾出未消化的組織及雜細胞。1 500 r/min 轉離心15 min 棄上清。完全培養(yǎng)液重懸細胞并接種到60 mm 培養(yǎng)皿中，細胞大約6 h 貼壁。12 h 換液，除掉雜細胞及未貼壁細胞。細胞置于37℃、5% CO2濃度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每48 h 換液，待細胞長滿培養(yǎng)皿。胰蛋白酶消化細胞，傳代培養(yǎng)。第三代細胞進行體外誘導，胰島素、地塞米松以及IBMX混合培養(yǎng)液作為誘導I 液誘導細胞，48 h 換誘導II 液（含胰島素的完全培養(yǎng)基），48 h 后換完全培養(yǎng)基。細胞繼續(xù)培養(yǎng)5 d，油紅O 染色驗證成熟的脂肪細胞。

1.3.2 引物設計及驗證 根據Genbank 中提供的綿羊基因Wnt/β-catenin 信號通路關鍵基因序列以及內參基因GAPDH序 列（NM_001190390.1），使 用Primer 5 軟件設計相關基因實時熒光定量PCR 引物序列（表1）。定量引物驗證，使用普通PCR 方法檢測引物特異性。PCR 反應體系20 μL：預混酶10 μL、上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL、模板 1 μL、ddH2O 8 μL；擴增條件為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s、退火溫度30 s、72℃延伸溫度30 s、35 個循環(huán)，72℃延伸8 min，4℃保存。產物經瓊脂糖凝膠電泳實驗，條帶單一引物可用于定量實驗。

表1 Wnt/β-catenin 信號通路關鍵基因引物序列

1.3.3 提取細胞分化過程中不同時間點RNA 前體脂肪細胞分化過程包含2 個階段，第一個階段是細胞增殖，當細胞布滿培養(yǎng)皿后細胞進入第二階段，即細胞分化。體外細胞分化為成熟的脂肪細胞需要誘導劑的參與。實驗從細胞整個分化過程中選擇4 個關鍵時間點用于驗證Wnt/β-catenin 信號通路關鍵基因變化規(guī)律。它們分別是：①細胞布滿培養(yǎng)皿時期，即細胞增殖期（第2天）；②細胞添加外源誘導I 液48 h 后，即細胞開始進入分化期（第4 天）；③細胞添加外源誘導II 液48 h后即細胞分化期中期（第6 天）；④細胞更換正常培養(yǎng)液48 h 后，即細胞分化期（第8 天）；采用TRIzol 試劑提取上述4 個時間點細胞總RNA，并反轉錄為cDNA。

1.3.4 實時熒光定量PCR 定量PCR 采用羅氏480 儀器以及配套試劑，qRT-PCR 體系為20 μL：Light Cycler 480 SYBR GreenI Master（2×）10 μL、ddH2O 8 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL。反應程序：95℃5 min，95℃ 10 s、60℃ 15 s、72℃ 20 s，共40 個循環(huán)，95℃ 5 s、65℃ 1 min、40℃ 10 s，每組實驗重復3 次。Roche Light Cycler 480 軟件進行數據分析。

1.4 數據分析 每組實驗重復3 次，數據以“平均值±標準差”表示，采用GraphPad Prism 軟件作圖，利用SPSS 17.0 軟件對數據進行單因素方差分析，顯著性水平定為P<0.05，極顯著水平定為P<0.01。

2 結果

2.1 綿羊前體脂肪細胞分離、培養(yǎng)、誘導、分化 前體脂肪細胞接種到培養(yǎng)皿后，顯微鏡下觀察細胞為呈球狀。通過細胞計數儀檢測其直徑大小約為10～30 μmol/L。細胞接種6 h 后開始貼壁，其形態(tài)呈不規(guī)則梭形。12 h換液去除未貼壁細胞，此時細胞開始進入快速增殖階段。當細胞布滿培養(yǎng)皿后出現(xiàn)生長抑制。添加外源誘導劑，細胞開始進入分化階段。當細胞分化一定階段后，內部有脂滴生成，經油紅O 染色，可以將脂滴染成紅色，驗證脂肪細胞誘導成功（圖1）。

圖1 油紅O 染色脂肪細胞圖

2.2 提取細胞總RNA 并驗證引物 實驗選擇細胞分化過程的第2 天、第4 天、第6 天、第8 天，共4 個時間點提取細胞總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳實驗以及分光光度計檢測，發(fā)現(xiàn)RNA 純度以及濃度均達到實驗要求可以進行后續(xù)實驗。由圖2 可知，引物特異性好，可以用于實時熒光定量PCR 檢測。

圖2 定量引物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 實時熒光定量PCR 以上述總RNA 為模板反轉錄成cDNA 分別檢測Wnt10b、Frizzled1、Frizzled2、GSK3β、LRP5、LRP6、β-catenin基因在脂肪分化過程中的表達規(guī)律。如圖3 所示，Wnt10b、Frizzled1、GSK3β、LRP5、LRP6基因表達量在第4 天顯著上升，然后出現(xiàn)顯著下降。Frizzled2基因在第4 天以及第8 天顯著下降。β-catenin基因只有在第8 天出現(xiàn)顯著上升。

圖3 實時熒光定量PCR 檢測基因相對表達

3 討 論

Wnt 蛋白是含有350～400 個氨基酸的分泌型糖蛋白，人類基因組中已發(fā)現(xiàn)有19 種Wnt 蛋白[4]。Wnt 蛋白調控多條信號通路，其中Wnt/β-catenin 信號通路是經典的Wnt 信號通路之一，最近有研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 信號通路在脂肪細胞形成過程中發(fā)揮重要作用，其中β-catenin作為第二信使具有重要的調節(jié)功能[5-6]。有研究表明，在生理條件下Wnt/β-catenin 信號通路是不活化的，保持較低的表達水平。細胞內GSK3β基因不斷磷酸化導致β-catenin基因不能發(fā)揮作用[7]。當外界信號刺激Wnt 蛋白，Wnt 活化轉移到細胞膜上結合細胞表面特異性受體卷曲蛋白Frizzled 并與低密度脂蛋白LRP5/6形成復合體抑制GSK3β基因表達，解除GSK3β基因對β-catenin的限制。細胞內的β-catenin不斷積累并進入細胞核與靶基因結合發(fā)揮作用[8-15]。有研究表明，Wnt10b基因在小鼠前體脂肪細胞增殖過程中高表達，添加成脂誘導劑后，其表達量減少，Wnt10b基因具有抑制脂肪細胞分化的能力[5,16]。因此本實驗選擇檢測Wnt/β-catenin 信號通路關鍵基因Wnt10b、Frizzled1、Frizzled2、GSK3β、LRP5、LRP6、β-catenin。

在本次實驗中發(fā)現(xiàn)，Wnt10b、Frizzled1、GSK3β、LRP5、LRP6基因在第4 天顯著上升，然后顯著下降。Wnt10b、Frizzled1、LRP5、LRP6在綿羊細胞增殖融合時以及添加外源誘導I 液時顯著表達。隨著分化的進行，其基因相對表達量顯著下降。實驗結果與Ross[5]的研究結果一致。這說明Wnt10b可能結合受體Frizzled1、LRP5、LRP6基因在綿羊脂肪細胞增殖過程高表達發(fā)揮作用，促進前體脂肪細胞增殖，同時抑制脂肪細胞分化。當細胞開始分化時Wnt10b表達被減弱，其受體Frizzled1、LRP5、LRP6基因表達也開始降低。稍有差別的是Wnt10b、Frizzled1、LRP5、LRP6、GSK3β基因只有在綿羊細胞快速增殖及添加誘導I 液時短時間高表達，這是與小鼠不同的地方。可能是因為在綿羊個體中Wnt其他成員參與此過程，表達時間不同。Frizzled2基因在第2 天以及第6 天顯著升高，在第4天以及第8 天顯著下降?？赡苁怯捎贔rizzled2基因對細胞增殖具有一定的促進作用，但是隨著誘導I 液的加入，一些促進細胞分化的因子開始表達如PPARγ、C/EBPα，導致Frizzled2基因被抑制。這可能說明在綿羊脂肪細胞分化過程中，F(xiàn)rizzled2基因不與Wnt10b基因結合，相反可能受其抑制。隨著Wnt10b基因表達量下降，F(xiàn)rizzled2基因表達量出現(xiàn)短暫上升，隨后由于具有抑制脂肪分化的功能，所以表達量又出現(xiàn)下降。β-catenin基因前6 天的趨勢與Wnt10b基因一致，只有在第8 天出現(xiàn)上升，可能是由于具有其他功能而導致的，具體機制需要進一步研究。

4 結 論

綿羊脂肪細胞分化過程中Wnt/β-catenin 信號通路發(fā)揮重要作用。其中關鍵基因Wnt10b、Frizzled1、Frizzled2、GSK3β、LRP5、LRP6、β-catenin均出現(xiàn)顯著變化。Wnt10b、GSK3β、Frizzled1、LRP5、LRP6基因在第4 天出現(xiàn)顯著升高，F(xiàn)rizzled2、β-catenin基因出現(xiàn)不同的變化趨勢，具體機制需要進一步研究。