李新淼，王圓圓，Heshuote Mailisi，白玉廷，包音都古榮·金花*，呼格吉勒圖，敖日格勒，侯榮倫，薛 強

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)生物制造重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；3.哥倫比亞大學，紐約 10027；4.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；5.內(nèi)蒙古賀斯格綠色產(chǎn)業(yè)進出口有限公司，內(nèi)蒙古烏拉蓋管理區(qū) 026321）

牛肉中的脂肪酸組成和含量是影響肉品質(zhì)的重要因素之一，特別是單不飽和脂肪酸（MUFA）含量，可降低脂肪熔點，使脂肪變得柔軟，有助于改善牛肉的風味和嫩度[1-2]。據(jù)報道[3]，遺傳因素在一定程度上調(diào)節(jié)脂肪酸組成，與脂肪酸代謝機制有關(guān)。硬脂酰CoA 去飽和酶1（Stearoyl-CoA desaturease1，SCD1）是催化飽和脂肪酸（SFA）發(fā)生脫氫反應轉(zhuǎn)化為MUFA 的去飽和酶，主要作用于SFA 中的棕櫚酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0），將其催化為MUFA 中的棕櫚油酸（C16:1）和油酸（C18:1）[4-6]。楊莉[7]發(fā)現(xiàn)寒冷環(huán)境下SCD1mRNA 表達量有所上升，說明寒冷環(huán)境有利于SCD1基因表達。Ohsaki[8]和Taniguchi[9]研究報道，黑毛和牛和荷斯坦牛的SCD1mRNA 表達水平與MUFA 含量的上升平行相關(guān)。Taniguchi[10]使用PCR-RFLP 方法將黑毛和?；蚓幋a區(qū)878 位點的基因型分為CC、TT 和CT 3 種，CC 型有更高的MUFA 百分比。本實驗選用烏拉蓋高寒草原飼養(yǎng)的澳洲進口純種西門塔爾母牛作為研究對象，通過測定血液中SCD1基因表達與脂肪酸組成和含量，分析SCD1基因及其不同基因型對C16:0 和C18:0 轉(zhuǎn)化為C16:1 和C18:1 的影響，為今后該品種母牛繁育中優(yōu)良遺傳基因的保留提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗牛均為48 月齡平均體重600 kg 未妊娠的純種西門塔爾母牛。實驗母牛在14 月齡時由澳大利亞進口，飼養(yǎng)在年平均氣溫-0.9℃的內(nèi)蒙古錫林郭勒盟烏拉蓋草原。采用每年6 月至9 月期間草原放牧、10 月至翌年5 月期間飼喂青貯加干草和全價料、自由運動的高寒草原飼養(yǎng)模式進行飼養(yǎng)。本實驗從200 頭牛群中隨機采取37 頭牛血液樣品，在清晨4 時放牧前使用含有EDTA 抗凝劑的15 mL 采血管從牛頸靜脈處采集血液，充分搖勻，移至無菌無酶的凍存管中，標記牛號，投入液氮中保存，用于實時熒光定量PCR 和脂肪酸含量及組成的測定。

1.2 總RNA 提取和cDNA 合成 采用TRIzol 法提取血液中的總RNA，提取的總RNA 經(jīng)微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測純度和完整性，符合要求后，立即使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit）進行cDNA 的合成。

1.3 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR 所使用的SCD1基因和內(nèi)參基因引物均參考唐慧等人[11]發(fā)表的引物序列。SCD1：5'-ATCCGCCCTGAAATGAGAG-3'（正向引物）和5'-GGGCTCCCAAGTGTAACA GA-3'（反向引物），內(nèi)參基因：5'-AAGGACCTCTACGCCAAC AC-3'（正向引物）和5'-ACA TCTGCTGGAAGGTGGA C-3'（反向引物）。目的基因和內(nèi)參基因引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以西門塔爾牛血液提取的cDNA 為模板，β-action 為內(nèi)參，利用LightCycler480 實時熒光PCR 系統(tǒng)進行實時定量擴增，每個樣品重復3 次。采用相對定量的方法，使用2-??Ct計算SCD1基因在西門塔爾母牛血液中的表達量。

1.4 全基因組DNA 提取和PCR 擴增 使用血液/ 細胞/ 組織基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取血液全基因組DNA。提取的DNA 經(jīng)微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測純度和完整性，符合要求后進行PCR 擴增，引物參考施雪奎等人[12]發(fā)表的SCD1基因引物序列設計：5'-ACCTGGCCTGGTGAATAGTGC-3'（正向引物）和5'-TGACATATGGAGAGGGGTCA-3'（反向引物），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反應在94℃變性5 min 后進行30 個循環(huán)，包括94℃變性30 s，56℃變性30 s，72℃變性1 min，72℃變性7 min。

1.5 PCR 產(chǎn)物檢測和基因分型 使用1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳，取3 μL PCR 擴增產(chǎn)物直接點樣，120V 電泳30 min，在凝膠成像儀上觀察擴增產(chǎn)物結(jié)果，選擇條帶清晰明亮的樣品，純化后，使用ABI 測序儀（3730xlDNAAnalyzer）進行一代測序。

1.6 脂肪酸組成及含量測定 參照簡路洋等[13]方法進行血液樣品的前處理和脂肪酸的提取、皂化與酯化處理。使用美國Agilent 公司產(chǎn)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890A-5975C）及Supelco SPTM-2560 氣相毛細管柱（100 m×0.25 mm×0.2 μm）分析脂肪酸組成含量。在上述操作條件下，測定37 種脂肪酸甲酯混合標準品，以確定不同脂肪酸組成的保留時間進行定性。采用面積歸一化法，通過測定相應峰面積對所有成分峰面積總和的百分數(shù)來計算每個脂肪酸的含量，用百分比表示。

1.7 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)采用Excel 軟件進行整理，數(shù)據(jù)分析采用IBM SPSS Statistics 25.0 進行獨立樣本t檢驗、ANOVA 方差分析和Pearson 相關(guān)分析。以P<0.05為顯著性檢驗標準。

2 結(jié)果

2.1 高寒草原飼養(yǎng)西門塔爾牛血液SCD1基因表達量和脂肪酸組成 實驗樣品中測得36 種脂肪酸，其中SFA 17 種，MUFA 8 種，多不飽和脂肪酸（PUFA）11 種。高寒草原飼養(yǎng)西門塔爾牛血液SCD1基因表達量和主要脂肪酸含量的顯著性分析結(jié)果如表1 所示，在高寒草原飼養(yǎng)的西門塔爾牛血液中SCD1基因mRNA 表達量為0.14。SFA 和MUFA 含量分別為49.88% 和26.73%，MUFA/SFA 比值為0.55。SFA 組成中具有高含量的C16:0（21.23%）和C18:0（24.93%），不飽和脂肪酸（UFA）中C18:1 含量（23.30%）為最高。在成脂基因中，SCD1基因表達量為0.14，其對西門塔爾牛血液脂肪酸中的肉豆蔻酸（C14:0）、肉豆蔻油酸（C14:1）、C16:0、C18:0 和C18:1，以及SFA、MUFA 和MUFA/SFA 的影響差異極顯著，而且對C14 指數(shù)、C16 指數(shù)、C18 指數(shù)和伸長指數(shù)的影響也表現(xiàn)出極顯著差異。

表1 高寒草原飼養(yǎng)西門塔爾牛血液SCD1 基因表達量和主要脂肪酸含量的顯著性分析

2.2 高寒草原飼養(yǎng)西門塔爾牛血液SCD1基因表達量與脂肪酸的相關(guān)性 由表2 可知，SCD1基因表達量與C16:0 和C18:0 含量呈負相關(guān)，與C16:1、C18:1（P<0.01）和MUFA（P<0.05）含量呈正相關(guān)。

表2 高寒草原飼養(yǎng)西門塔爾牛血液SCD1 基因表達量與不同脂肪酸含量的相關(guān)性分析

2.3SCD1基因分型結(jié)果 利用引物對高寒草原飼養(yǎng)的純種西門塔爾牛血液全基因組DNA 進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，與預期片段大小一致，且沒有非特異性條帶，純化后進行一代測序。測序結(jié)果如圖1 所示，與GenBank 中的序列（AY241933）比對結(jié)果表明，在878 位置處發(fā)現(xiàn)了C/T 突變，根據(jù)其測序圖譜可將SCD1基因分為3 種基因型，分別定義為TT 型、CC 型和CT 型。

圖1 C878T 位點擴增產(chǎn)物測序圖譜

2.4SCD1基因不同基因型對高寒草原飼養(yǎng)西門塔爾牛血液脂肪酸組成的影響 對高寒草原飼養(yǎng)的西門塔爾牛血液SCD1基因進行分型，共得到3 種基因型，分別為CC 型、TT 型和CT 型，其基因型頻率分別0.432、0.108、0.459，C 和T 等位基因頻率分別為0.66 和0.34。SCD1基因型對西門塔爾母牛血液脂肪酸組成影響如表3 所示。CC 型牛血液中具有高含量的SFA（52.96%）和C18:0（27.11%），顯著高于CT 型的相同脂肪酸含量，CT 型的C18:0 和SFA 分別為22.81%和46.90%（P<0.05），但與TT 型無顯著性差異。TT 型具有較高的MUFA（28.06%）、C16:0（21.66%）和C18:1（24.73%）含量；CT 型具有高含量的C14:0（0.78%）、C14:1（0.85%）和C18:2（17.80%），以及高比值的M/S（0.60）、C14 指數(shù)（0.52）、C16 指數(shù)（0.07）和C18 指數(shù)（0.51），上述脂肪酸組成在CC、TT 和CT 3 種基因型之間無顯著性差異。SCD1不同基因型伸長指數(shù)均為0.68。

表3 SCD1 基因型對高寒草原飼養(yǎng)西門塔爾牛血液脂肪酸組成的影響 %

3 討 論

SCD1作為合成MUFA 的限速酶，其表達量影響MUFA 的含量。Yang[14]、Smith[15]和Shorten[16]發(fā) 現(xiàn)，SCD1酶活性與牛脂肪組織中的UFA 含量、SCD1基因表達與MUFA 含量均呈正相關(guān)。唐慧等[11]研究得到SCD1基因表達量分別與MUFA、C16:1 和C18:1 含量呈正相關(guān)的結(jié)果。本實驗對SCD1基因表達與血液中脂肪酸組成和含量進行顯著性和相關(guān)性分析，結(jié)果表明，SCD1基因表達 對SFA 和MUFA 以 及SFA 中C16:0、C18:0，MUFA 中C16:1、C18:1 均具有極顯著影響。SCD1基因表達與MUFA 含量呈顯著正相關(guān)，與C18:1含量呈極顯著正相關(guān)，與C16:1 含量呈正相關(guān)，這些正效應結(jié)果與唐慧[11]研究結(jié)果一致。本實驗中SCD1基因表達與C16:0 和C18:0 含量均呈負相關(guān)，表現(xiàn)出負效應，說明SCD1基因表達直接影響棕櫚酸和硬脂酸向棕櫚油酸和油酸的轉(zhuǎn)化，從而調(diào)控MUFA 的合成。SCD1基因?qū)Ω吆菰曫B(yǎng)的純種西門塔爾牛血液脂肪酸具有較大的遺傳效應，可用于其脂肪酸的分子標記輔助選擇。

高寒草原飼養(yǎng)西門塔爾牛血液中的SCD1基因在878 位點出現(xiàn)變異導致氨基酸發(fā)生突變，即丙氨酸（等位基因C）轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸（等位基因T），等位基因頻率的不同影響品種牛選種培育的難度。Moioli 等[17]統(tǒng)計分析了西門塔爾牛第5 外顯子878 多態(tài)位點的等位基因C/T 的頻率分別為0.52 和0.48，武秀香等[18]發(fā)現(xiàn)，在中國西門塔爾牛群體中C/T 基因頻率分別為0.663 和0.337。本實驗中西門塔爾牛等位基因C/T 的頻率分別為0.66 和0.34，與Moioli[17]和武秀香[18]研究結(jié)果相似。SCD1基因在878 位點突變?yōu)镃C、TT 和CT 3 種基因型，根據(jù)Taniguchi[10]對黑毛和牛的研究，CC 型具有更高的MUFA 百分比，而本實驗結(jié)果顯示，高寒草原飼養(yǎng)的西門塔爾牛血液SCD1基因中的CC 型具有高含量的C18:0 和SFA，而TT 型具有較高的MUFA 百分比。本實驗中未發(fā)現(xiàn)SCD1基因型對C14:0、C14:1、C16:0和C16:1 的遺傳效應，表明高寒草原飼養(yǎng)的西門塔爾牛SCD1基因?qū)18:0 的轉(zhuǎn)化能力高于C14:0 和C16:0。伸長指數(shù)表示從16 個碳原子到18 個碳原子的轉(zhuǎn)化程度[19-20]，本實驗樣品中SCD1基因表達對伸長指數(shù)有顯著影響，但不同基因型之間的伸長指數(shù)均為0.68，說明SCD1基因影響C16:0、C18:0、C16:1 和C18:1 之間的轉(zhuǎn)化，在此過程中SCD1的不同基因型受該轉(zhuǎn)化影響不顯著。

4 結(jié) 論

綜上所述，高寒草原飼養(yǎng)的純種西門塔爾牛血液中含有豐富的脂肪酸組成，血液SCD1基因表達對C16:0、C18:0、C16:1、C18:1 和MUFA 具有差異顯著性和相關(guān)性。SCD1基因在878 位點存在突變，表現(xiàn)為CC、TT 和CT 3 種基因型，CC 型有高含量的硬脂酸和SFA。SCD1基因可以作為高寒草原飼養(yǎng)下西門塔爾牛品種培育和評估的重要候選基因。