張 可，紀(jì)皓楠，柴 河，姜立鑫，趙 曼，佟 彬，郭 峰，吳宏軍，劉愛(ài)榮，王雅春*，張 毅*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.海拉爾農(nóng)牧場(chǎng)管理局謝爾塔拉農(nóng)牧場(chǎng)，內(nèi)蒙古呼倫貝爾 021012；3.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010071；4.內(nèi)蒙古通遼市畜牧業(yè)發(fā)展中心，內(nèi)蒙古通遼 028000）

三河牛是我國(guó)自主培育的乳肉兼用牛品種，起源于內(nèi)蒙古呼倫貝爾額爾古納右旗的三河地區(qū)（根河、哈烏爾河、得勒布爾河）及呼倫貝爾市境內(nèi)濱州鐵路沿線一帶。自品種育成以來(lái)，三河牛一直保持品系選育的育種方法[1]，除了高產(chǎn)奶系和高產(chǎn)肉系，還選育形成一個(gè)無(wú)角品系，在當(dāng)?shù)厮追Q(chēng)“禿頭系”，具有爭(zhēng)斗少、易管理的優(yōu)點(diǎn)。

目前已報(bào)道的牛無(wú)角基因主要有3 個(gè)獨(dú)立的來(lái)源：安格斯牛、西門(mén)塔爾牛等肉牛和兼用牛品種中的凱爾特?zé)o角基因（Celtic），荷斯坦牛、娟珊牛等奶牛品種中的弗里生無(wú)角基因（Friesian），在蒙古國(guó)的牛和牦牛中發(fā)現(xiàn)的蒙古牛無(wú)角基因（Mongolian）[2]。這些無(wú)角基因均定位于牛1 號(hào)染色體起始區(qū)域，但突變類(lèi)型各不相同[3]。凱爾特?zé)o角基因是一段長(zhǎng)度為212 bp 的重復(fù)，代替了長(zhǎng)度為10 bp 的原序列，即P202ID位點(diǎn)[4]；弗里生無(wú)角基因源于一個(gè)長(zhǎng)度80 kb 片段的重復(fù)，即P80kbID位點(diǎn)[4]；蒙古牛無(wú)角基因則是一個(gè)長(zhǎng)度219 bp 的重復(fù)片段的插入，即P219ID位點(diǎn)[5]。此外，最近在南美洲的尼爾洛牛（Nellore）中新發(fā)現(xiàn)一個(gè)瘤牛特異的無(wú)角基因，序列特征為一個(gè)110 kb 片段的重復(fù)[6]。

牛的無(wú)角性狀屬于常染色體顯性遺傳[7]，因此攜帶任何一種無(wú)角基因均呈現(xiàn)無(wú)角。三河牛的培育過(guò)程經(jīng)歷了多品種雜交，含有本地牛、西門(mén)塔爾牛、西伯利亞牛、俄羅斯改良牛、后貝加爾土種牛等眾多品種的血緣[1]，目前關(guān)于三河牛無(wú)角基因的具體來(lái)源尚不清楚。因此，本研究通過(guò)對(duì)三河牛和蒙古牛的無(wú)角基因進(jìn)行分子檢測(cè)，探究三河牛無(wú)角基因的來(lái)源，從而為三河牛無(wú)角品系的高效選育提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣本及其基因組DNA 的提取 從內(nèi)蒙古謝爾塔拉農(nóng)牧場(chǎng)選擇三河牛無(wú)角品系公牛3 頭，有角公牛4 頭（圖1），收集冷凍精液樣本。在內(nèi)蒙古阿拉善盟阿拉善左旗采集21 頭蒙古牛的血液樣本。利用試劑盒（基因組DNA 提取試劑盒DP304，北京天根生化科技有限公司）提取血液樣本DNA；利用高鹽法[3]提取牛凍精基因組DNA。利用Thermo Scientific NanoDrop 2000 檢測(cè)基因組DNA 質(zhì)量和濃度，剔除經(jīng)檢測(cè)不合格的樣本1 個(gè)。此外，選擇基因型已知的無(wú)角西門(mén)塔爾牛（Celtic 無(wú)角基因）和無(wú)角荷斯坦牛（Friesian 無(wú)角基因）各1 頭為對(duì)照[3]。

圖1 無(wú)角三河牛和有角三河牛

1.2 引物合成與PCR 擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳

1.2.1 引物合成 檢測(cè)3 種無(wú)角基因的特異性引物序列來(lái)自文獻(xiàn)報(bào)道（表1），由擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

表1 3 種無(wú)角基因分子檢測(cè)PCR 引物信息

1.2.2 目標(biāo)序列擴(kuò)增與凝膠電泳 PCR 反應(yīng)體系總體積20 μL，其 中10×Buffer 2 μL，dNTP 混合物（各2.5 mmol/L）1.6 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.15 μL，上下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL，基因組DNA 模板1 μL（約50 ng），ddH2O 14.25 μL 補(bǔ)齊剩余體積。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性8 min；然后35 個(gè)循環(huán)，95℃變性30 s，在引物對(duì)應(yīng)的退火溫度下復(fù)性30 s，72℃延伸1 min；最后72℃延伸10 min。

制作濃度為2%的瓊脂糖凝膠，取PCR 產(chǎn)物4 μL點(diǎn)樣，在TAE 緩沖液中110 V 電壓下電泳20 min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果。各樣本編號(hào)對(duì)應(yīng)牛只信息如表2 所示。

表2 29 個(gè)樣本3 種無(wú)角基因的分子檢測(cè)結(jié)果

1.3 PCR 產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證 PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖電泳條帶經(jīng)切膠回收后進(jìn)行測(cè)序。使用Chromas 軟件查看測(cè)序結(jié)果，使用ContigExpress 軟件拼接和校對(duì)正反向測(cè)序序列，使用MEGA-X 軟件（https://megasoftware.net）進(jìn)行個(gè)體間序列對(duì)比。對(duì)蒙古牛無(wú)角基因輔以克隆測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果 由圖2 可知，蒙古牛無(wú)角基因位點(diǎn)（P219ID）檢測(cè)結(jié)果中長(zhǎng)度為895 bp的條帶對(duì)應(yīng)野生型，長(zhǎng)度為1 112 bp 的單條帶對(duì)應(yīng)無(wú)角基因，雙條帶對(duì)應(yīng)無(wú)角雜合子（圖2A）。根據(jù)電泳條帶可以得知，樣本中2 頭無(wú)角蒙古牛（M1 和M2）的基因型為P219ID位點(diǎn)雜合子；3 頭無(wú)角三河牛中，有2頭（301 和83245）的基因型為P219ID雜合子，1 頭（15233）為P219ID純合子，所有有角個(gè)體的基因型都屬于野生型。另外，所有蒙古牛和三河牛樣本均沒(méi)有檢出歐洲牛特有的凱爾特?zé)o角基因（P202ID位點(diǎn)）以及弗里生無(wú)角基因（P80kbID位點(diǎn)）（圖2B、2C）。

圖2 3 種無(wú)角基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 為了驗(yàn)證PCR 產(chǎn)物凝膠電泳分型的準(zhǔn)確性，對(duì)P219ID位點(diǎn)電泳產(chǎn)物中來(lái)自無(wú)角個(gè)體的條帶進(jìn)行切膠回收和Sanger 測(cè)序，長(zhǎng)度為1 112 bp 的條帶配合使用克隆測(cè)序，雜合個(gè)體的兩條帶均進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果顯示，P219ID位點(diǎn)無(wú)角等位基因相對(duì)于野生型原序列是一種復(fù)雜的突變，有3 處變異：1）原序列（219 bp，基因組位置Chr1:1 976 128～1 976 345 bp，參考基因組版本Bos_taurus_UMD_3.1.1）下游間隔61 bp 存在1 個(gè)新拷貝（219 bp）；2）原序列上游621 bp處有1 個(gè)缺失-插入變異（7 bp 序列替換為6 bp 序列）；3）第一個(gè)拷貝中相對(duì)野生型序列有1 個(gè)單堿基突變（C →G）（圖3）。這3 個(gè)變異同時(shí)出現(xiàn)，故很可能是完全連鎖的。本研究測(cè)序發(fā)現(xiàn)，三河牛無(wú)角純合子個(gè)體（15233）及雜合子個(gè)體（301、83245）的1 112 bp條帶（突變型PCR 片段）均檢出了以上2 種特征性突變，蒙古牛無(wú)角雜合子個(gè)體（M1、M2）的1 112 bp 條帶也呈現(xiàn)了相同的測(cè)序結(jié)果，而三河牛與蒙古牛野生型個(gè)體及無(wú)角雜合子個(gè)體的895 bp 條帶（野生型PCR 片段）的測(cè)序結(jié)果則均與野生型參考序列相吻合（圖3）。

圖3 蒙古牛類(lèi)型無(wú)角基因突變位點(diǎn)在基因組上的位置與分型引物示意圖及試驗(yàn)樣本在對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果

3 討 論

牛角作為?？苿?dòng)物特有的身體結(jié)構(gòu)，是長(zhǎng)期自然選擇的結(jié)果[8-9]，但在現(xiàn)代規(guī)?；B(yǎng)殖中，牛角成為影響生產(chǎn)安全的因素。目前牛場(chǎng)生產(chǎn)中一般在犢牛時(shí)期使用機(jī)械或化學(xué)方法去角，但這不僅會(huì)造成動(dòng)物的應(yīng)激、影響生長(zhǎng)，也不利于動(dòng)物福利[10-11]。因此，國(guó)際上一直在研究培育天然的無(wú)角牛品種來(lái)擺脫這樣的困境[12-13]。除了常規(guī)育種之外，也有利用基因編輯技術(shù)快速培育無(wú)角牛的先例[14]。我國(guó)科學(xué)家還開(kāi)展了牦牛無(wú)角基因的定位研究[15-16]和無(wú)角牦牛品種的選育[17]，并在2019 年培育出無(wú)角牦牛品種——阿什旦牦牛。三河牛是我國(guó)1983 年正式命名的乳肉兼用牛品種，培育過(guò)程是以?xún)?nèi)蒙古額爾古納右旗三河地區(qū)的蒙古牛為主要母本，以西門(mén)塔爾牛、西伯利亞牛、俄國(guó)改良牛等外來(lái)品種為父本經(jīng)長(zhǎng)期雜交和選育而成。三河牛毛色以紅白花為主，體質(zhì)結(jié)實(shí)勻稱(chēng)，頭部清秀，蹄質(zhì)堅(jiān)實(shí)，產(chǎn)奶量和乳脂率、乳蛋白率較高且產(chǎn)肉性能優(yōu)良；另外，三河牛還具有優(yōu)良的適應(yīng)性和抗病能力、較高的繁殖率[1]。當(dāng)前三河牛飼養(yǎng)中仍然主要使用人工去角，但本研究結(jié)果有望加快其無(wú)角品系的培育，使三河牛具備更加突出的優(yōu)勢(shì)。

蒙古牛無(wú)角基因最早由Medugorac 等[5]通過(guò)基因組測(cè)序在蒙古國(guó)當(dāng)?shù)嘏＃∕ongolian Turano cattle）上發(fā)現(xiàn)，谷明娟等[18]在我國(guó)北方的無(wú)角蒙古牛中也檢測(cè)到這一基因類(lèi)型。該位點(diǎn)無(wú)角基因在我國(guó)的部分培育牛品種中也有報(bào)道，如云嶺牛[19]、蜀宣花牛[20]，但在這些品種中，蒙古牛無(wú)角基因頻率很低，而凱爾特（Celtic）無(wú)角基因更為常見(jiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)三河牛的無(wú)角基因與蒙古牛的無(wú)角基因序列相同，都屬于Mongolian 無(wú)角基因類(lèi)型（P219ID）。結(jié)合三河牛的育種過(guò)程可知，三河牛的無(wú)角基因來(lái)源于蒙古牛。顏澤等[3]采用整合競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（Kompetitive Allele-Specific PCR,KASP）技術(shù)對(duì)1 頭三河牛無(wú)角個(gè)體的無(wú)角基因類(lèi)型進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果與本研究相符。同時(shí)，電泳分型結(jié)果與測(cè)序結(jié)果的一致性也驗(yàn)證了基于PCR 技術(shù)的蒙古牛無(wú)角基因分子檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。

本研究鑒定了1 頭三河牛無(wú)角純合種公牛，由于目前仍保存了該公牛一定數(shù)量的冷凍精液，相比于利用年限較短的母畜，這一無(wú)角純合種公牛個(gè)體凍精的有效使用更加有利于無(wú)角三河牛群體的擴(kuò)大[21]。由于無(wú)角是顯性遺傳，使用無(wú)角純合子公牛配種，后代都攜帶無(wú)角基因，表型全部為無(wú)角，因此在未來(lái)較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)可以繼續(xù)利用其凍精進(jìn)行三河牛無(wú)角品系的培育。生產(chǎn)中天然的無(wú)角性狀屬于有利性狀，但三河牛的育種目標(biāo)始終是提升其綜合性能，不能顧此失彼，因此在利用分子技術(shù)手段準(zhǔn)確篩選無(wú)角基因的同時(shí)，需要對(duì)重要經(jīng)濟(jì)性狀不斷進(jìn)行選育；與此同時(shí)，通過(guò)豐富種公牛血緣從而避免近交，才能最終獲得性能優(yōu)異且天然無(wú)角的優(yōu)良三河牛品系。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)分子檢測(cè)方法鑒定了三河牛無(wú)角性狀的基因型，證明其無(wú)角基因來(lái)源于蒙古牛，豐富了對(duì)我國(guó)牛品種遺傳資源特色性狀的認(rèn)識(shí)，也為選育我國(guó)無(wú)角牛品種提供了技術(shù)支撐。